Anlage 1.4

(zu § 10 Absatz 2)

Methoden zur Untersuchung von Fleisch

1.

Allgemeines

Soweit keine bestimmten Methoden festgelegt sind, müssen wissenschaftlich anerkannte und, soweit möglich, validierte Verfahren angewendet werden wie

-

die in der amtlichen Sammlung nach § 35 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LMBG) in der Fassung der Bekanntmachung vom 9. September 1997 (BGBl. I S. 2296, zuletzt geändert durch Artikel 9 § 1 Nummer 1 des Gesetzes vom 6. August 2002 (BGBl. I S. 3082) oder § 64 des Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches (LFGB) bekannt gemachten Untersuchungsverfahren,

-

die im Bundesgesundheitsblatt bekannt gemachten vorläufigen Methoden nach § 35 LMBG oder § 64 LFGB sowie

-

von anderen Normungsausschüssen (International Standardizing Organization ‑ ISO, Europäische Normung ‑ EN, Deutsches Institut für Normung ‑ DIN) verabschiedete Untersuchungsverfahren.

2.

Bakterioskopische Untersuchung

2.1

Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode beschreibt ein mikroskopisches Verfahren zur Abschätzung der Keimbelastung und -verteilung auf oder in Fleisch und Fleischerzeugnissen anhand eines gefärbten Abdruckpräparates. Sie erlaubt nur eine grobe Abschätzung der mikrobiellen Belastung des Untersuchungsmaterials. Eine Unterscheidung zwischen vermehrungsfähigen und abgetöteten Keimen ist nicht möglich.

2.2

Kurzbeschreibung

Flächen (Oberflächen, Bohrlinge oder Schnittflächen) des Untersuchungsmaterials werden auf einem Objektträger abgedrückt. Das dabei übertragene Material wird einer Bakterienfärbung unterzogen und anschließend mikroskopisch untersucht. Außer Bakterien werden mit diesem Verfahren auch Hefen und Schimmelpilze nachgewiesen.

2.3

Chemikalien

2.3.1

Chemikalien für die Bakterienfärbung nach Gram;

2.3.2

Äthanol oder Spiritus 95 %¹⁾;

2.3.3

Isopropanol 70 %¹⁾;

2.3.4

Diäthyläther p.a.²⁾.

2.4

Geräte und Hilfsmittel

Die für die Probenahme benötigten Geräte müssen vor Verwendung sorgfältig gereinigt und desinfiziert werden.

2.4.1

Skalpell, gerade Schere und Pinzette;

2.4.2

Becherglas, Nennvolumen 100 ml, mit Deckel, zum Bereithalten von Äthanol;

2.4.3

Becherglas, Nennvolumen 100 ml, mit Deckel, zum Auffangen von abtropfendem Diäthyläther;

2.4.4

Tropfpipette;

2.4.5

Glas-Objektträger;

2.4.6

Binokulares Durchlichtmikroskop mit Beleuchtungseinrichtung und 1000facher Vergrößerung (bei Ölimmersion);

2.4.7

Immersionsöl für die Mikroskopie;

2.4.8

Färbevorrichtung (Färbebank, Färbegefäße, Objektträgerpinzetten);

2.4.9

Bunsenbrenner;

2.4.10

Zellstoff, steril, ungebleicht.

2.5

Untersuchungsmaterial

2.5.1

Unverpacktes Untersuchungsgut

Je nach Untersuchungsziel wird ein Abdruckpräparat von der Oberfläche oder von einem aus der Tiefe entnommenen Probenteil angefertigt.

2.5.2

Untersuchungsgut in luftdicht verschlossenen Behältnissen

Die Oberfläche des Behältnisses wird unmittelbar vor Untersuchungsbeginn mit äthanol- oder spiritusgetränktem Zellstoff gereinigt und bei hitzeresistentem Verpackungsmaterial durch Abflammen mit Äthanol oder Spiritus an der Stelle, an der das Behältnis geöffnet werden soll, keimfrei gemacht. Falls die Art des Verpackungsmaterials dies nicht zulässt (zum Beispiel bei Kunststofffolie), wird ein mit Isopropanol getränktes Zellstofftuch für einige Minuten auf die entsprechende Stelle der Behältnisoberfläche gelegt.

Sofern Öffnungsvorrichtungen (Schraubverschluss, Aufreissclip) nicht vorhanden sind, ist zum Öffnen je nach Verpackungsmaterial ein keimfrei gemachter Dosenöffner oder eine keimfrei gemachte Schere zu verwenden.

Es sind Oberflächen- und Tiefenproben zu entnehmen.

2.5.2.1

Oberflächenprobe

Bei luftdicht verschlossenen Dosen ist Material am Übergang zur Längsnaht (Deckelbördelung) oder am Übergang von der Längsnaht oder -verschweißung zur Dosenbördelung, bei Folienverpackung an der Querversiegelung, zu entnehmen.

2.5.2.2

Tiefenprobe

Es ist Material aus dem geometrischen Mittelpunkt des Füllgutes (Kern) zu entnehmen.

2.6

Durchführung

Mit sterilen Entnahmegeräten werden von der Oberfläche der zu untersuchenden Probe Würfel mit einer Kantenlänge von 1 cm herausgeschnitten und mit der von der Probenoberfläche stammenden Würfelseite auf dem Objektträger abgedruckt; alternativ kann ein Objektträger direkt auf den zu untersuchenden Oberflächenteil des Probenwürfels gelegt und kurz angepresst werden.

Vor der Entnahme von Material aus der Tiefe der Probe ist die Oberfläche des Füllgutes zur Vermeidung einer Verschleppung von Keimen in die Tiefe kurz und kräftig abzuflammen (Bräunung bis etwa 2 mm Tiefe). Mit sterilen Entnahmegeräten wird an der erforderlichen Stelle Material entnommen und auf einem Objektträger abgedruckt.

Die Entnahmegeräte sind bei jeder Probe zu wechseln. Während der Entnahme von Unterproben von derselben Probe ist eine Zwischendesinfektion in Äthanol oder Spiritus mit anschließendem Abflammen des Alkohols nach jeder Unterprobe ausreichend.

Die Abdruckpräparate werden 60 Minuten bei Zimmertemperatur luftgetrocknet oder 30 Minuten im Brutschrank bei +30 °C hitzefixiert. Anschließend werden sie über einem Becherglas vorsichtig dreimal durch Auftropfen von Diäthyläther auf das Präparat entfettet. Nach völliger Abtrocknung wird das auf die Objektträger übernommene Untersuchungsmaterial durch dreimaliges langsames Durchziehen durch die „kalte“ Flamme eines Brenners hitzefixiert und die Bakterienfärbung durchgeführt. Dabei ist zu beachten, dass gegenüber Ausstrichpräparaten die Abdruckpräparate meist ein geringeres Haftungsvermögen auf dem Objektträger aufweisen. Daher ist eine schonende Färbung auf einer Färbebank zu empfehlen.

Die Färbung nach Gram erfolgt nach Labor-Vorschrift.

Nach Abschluss der Färbung wird das Präparat unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung (mit Ölimmersion) und einer Sehfeldzahl von 18 bis 22 untersucht. Die Überprüfung auf das Vorhandensein gramnegativer Keime ist besonders sorgfältig vorzunehmen, da von einer störenden Rotfärbung des Untergrundes durch das Untersuchungsgut auszugehen ist.

Der präparierte Objektträger ist ‑ sofern er nicht zu Vergleichszwecken vorübergehend aufgehoben wird ‑ wie infektiöses Material zu behandeln und entsprechend zu entsorgen.

2.7

Auswertung

Es wird die Anzahl der pro Gesichtsfeld nachgewiesenen Mikroorganismen (arithmetisches Mittel aus 20 Gesichtsfeldern) in folgender Abstufung angegeben:

„vereinzelt“	bei weniger als 2 Keimen;
„mäßig“	bei 2 bis 10 Keimen;
„zahlreich“	bei mehr als 10 Keimen.

Bei vollständig haltbar gemachten Fleischerzeugnissen in luftdicht verschlossenen Behältnissen ist in den Fällen, in denen in 20 Gesichtsfeldern (bezogen auf eine Sehfeldzahl von 20) insgesamt mehr als 30 Keime nachgewiesen werden, eine kulturelle Untersuchung durchzuführen. Diese erfolgt nach fünftägiger Bebrütung eines noch luftdicht verschlossenen Behältnisses bei +37 °C und anschließender zwölfstündiger Lagerung bei etwa +4 °C nach den unter Nummer 3.7 (anaerober Keimgehalt) und ggf. Nummer 3.4 (aerober Keimgehalt) genannten Verfahren.

2.8

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;

-

Art und Datum der Probenahme;

-

Eingangs- und Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von dieser Methode abgewichen wurde.

3.

Bakteriologische Untersuchung (BU)

3.1

Zweck und Anwendungsbereich

3.1.1

Die Bakteriologische Untersuchung dient als Hilfsmittel zur Beurteilung von Einzeltieren im Rahmen der Fleischuntersuchung. Zur Sicherstellung einer sachgerechten Durchführung der Untersuchungen und der Aussagekraft der Ergebnisse ist in besonderem Maße auf die entsprechende Entnahme des Probenmaterials und die Einhaltung der Kühlkette während der Lagerung und des Transports zu achten. Im Rahmen der Bakteriologischen Untersuchung ist auch eine Untersuchung auf Hemmstoffe durchzuführen.

3.1.2

Im Antrag auf Durchführung einer Bakteriologischen Untersuchung sollten alle zweckdienlichen Angaben (zum Beispiel pathologische Veränderungen) und ggf. zusätzliche Untersuchungsziele (zum Beispiel Rotlauf) angegeben werden. Dieser Antrag erfasst auch die Durchführung von Rückstandsuntersuchungen nach Nummer 3.9.

3.1.3

Es werden Methoden beschrieben, die zur semiquantitativen Bestimmung des sonstigen Keimgehaltes sowie zum qualitativen Nachweis von Rotlauf-Erregern, Salmonellen und obligat anaeroben grampositiven Stäbchen (Clostridien) geeignet sind. Zur Untersuchung auf Milzbrand wird auf die Arbeitsanleitung zur Labordiagnostik von anzeigepflichtigen Tierseuchen nach der Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 23. Mai 1991 (BGBl. I S. 1178) in der jeweils geltenden Fassung verwiesen.

3.1.4

Die Anwendung anderer als der unter den Nummern 3.4 bis 3.7 beschriebenen Nachweisverfahren oder die Verwendung anderer als der dort genannten Nährmedien ist nur dann zulässig, wenn deren Gleichwertigkeit durch geeignete Vergleichsuntersuchungen sichergestellt ist. Anstelle der dort genannten Nährmedien können auch hinreichend erprobte, im Handel erhältliche Systeme eingesetzt werden. Die Anwendung anderer Nachweisverfahren oder die Verwendung anderer Nährmedien muss dokumentiert werden.

3.2

Auswahl, Entnahme und Versand der Proben

3.2.1

Zur Durchführung der Bakteriologischen Untersuchung, ausgenommen bei Geflügel und Federwild, sind folgende Proben zu entnehmen:

3.2.1.1

aus der Muskulatur der Vorder- oder Hinterextremität einer Schlachtkörperhälfte ein ganzer, von Faszien umhüllter Muskelbauch oder ein zusammenhängendes Muskelstück (von ca. 6 bis 8 cm Seitenlänge) aus dem Bereich der Untergliedmaßen. Liegen diese nicht in entsprechender Größe vor, ist ein anderer Muskel, zum Beispiel aus der Adduktorengruppe im Bereich der Beckensymphyse („Fleischspiegel“) zu wählen;

3.2.1.2

aus der anderen Schlachtkörperhälfte der Bug- oder der große innere Darmbeinlymphknoten mit dem umhüllenden Fett- oder Bindegewebe;

3.2.1.3

die Milz, bei großen Schlachttieren oder bei erheblicher Schwellung ein handgroßes Stück;

3.2.1.4

eine Niere;

3.2.1.5

ein faustgroßes Stück Lebergewebe aus dem Bereich der Leberpforte oder der Spigelsche Lappen mit der Leberpforte oder bei kleineren Tieren die ganze Leber;

3.2.1.6

als Zusatzproben sind fallweise zu entnehmen:

3.2.1.6.1

veränderte Teile (zum Beispiel Herz oder Herzklappen bei Rotlaufverdacht), ggf. mit dazugehörigen Lymphknoten je nach erhobenem Verdacht;

3.2.1.6.2

bei Tieren aus Salmonellen-Ausscheiderbeständen³⁾, die selbst bisher nicht als Ausscheider in Erscheinung getreten sind, sowie bei Tieren, die zur Serum- und Impfstoffgewinnung gedient haben, ein ca. 10 cm langes Dünndarmstück mit den dazugehörigen Lymphknoten.

3.2.2

Zur Durchführung der Bakteriologischen Untersuchung bei Geflügel, Zuchtlaufvögeln und Federwild kann bei Geflügel oder Zuchtlaufvögeln, die unter gleichen Fütterungs- und Haltungsbedingungen in einem Bestand gehalten werden oder bei Federwild, das aus demselben Jagdrevier stammt, auf eine für die Beurteilung ausreichende Zahl repräsentativer Stichproben beschränkt werden.

3.2.3

Die Entnahme der Proben hat mit abgeflammten oder mit durch sonstige Hitze entkeimten Instrumenten zu erfolgen. Lymphknoten und Niere sollen möglichst nicht angeschnitten werden. Proben, bei denen nicht innerhalb einer Stunde mit der Untersuchung begonnen werden kann, sind vor der Umverpackung durchzukühlen, jedoch nicht einzufrieren.

Die einzeln in flüssigkeitsundurchlässigem Material verpackten Proben sind auslaufsicher zu verpacken und danach in einem wärmeisolierten Transportbehältnis mit geeignetem Füllmaterial zu umgeben.

Der Versand ist ohne Verzug und auf dem schnellsten Wege durchzuführen. Es ist zu gewährleisten, dass in den Proben eine Temperatur von +10 °C nicht überschritten wird. Die Transportgefäße müssen erforderlichenfalls mit zusätzlichen Vorrichtungen zur Kältespeicherung (Kühlelemente) beschickt sein.

3.2.4

Der Antrag auf Bakteriologische Untersuchung ist so beizufügen, dass er nicht verunreinigt wird.

Auf einen besonderen Verdacht, insbesondere auf Milzbrand oder Rotlauf, ist neben der Angabe im Antrag zusätzlich und leicht lesbar auf einem Packzettel hinzuweisen; dieser Packzettel ist so beizufügen, dass er beim Öffnen des Transportbehältnisses nicht übersehen werden kann.

3.2.5

Aufbewahrung des der Bakteriologischen Untersuchung unterliegenden Schlachtkörpers und Fleisches

Der Schlachtkörper, bei dem eine Bakteriologische Untersuchung eingeleitet worden ist, ist mit allen Nebenprodukten der Schlachtung bis zum Abschluss der Untersuchungen vorläufig zu beschlagnahmen und so aufzubewahren, dass ein Berühren des Fleisches durch Unberufene und insbesondere eine mittelbare oder unmittelbare Berührung mit anderem Fleisch oder anderen Lebensmitteln verhindert wird. Der Schlachtkörper oder das Fleisch ist während dieser Zeit luftig und kühl aufzubewahren. Nebenprodukte der Schlachtung und sonstige Teile des Schlachtkörpers, die untauglich bzw. von der Beurteilung ausgenommen sind, können vor Abschluss der Bakteriologischen Untersuchung beseitigt werden, sofern sie für Probenahmen nicht aufbewahrt werden müssen.

3.3

Entnahme der Teilproben

Bei einem vom Einsender geäußerten Verdacht auf Milzbrand oder Rotlauf sind entsprechende Sicherheitsmaßnahmen zu beachten.

Die zu untersuchenden Teilproben sind aus der Tiefe der eingesandten Gesamtproben zu entnehmen. Hierzu ist zunächst anhaftendes Binde- und Fettgewebe zu entfernen und anschließend die Oberfläche des zur Entnahme der Teilprobe vorgesehenen Bereiches ‑ bei kleinen Proben, wie Lymphknoten, die gesamte Oberfläche ‑ durch Hitze bis zu einer Tiefe von 1 bis 2 mm sichtbar zu denaturieren. Danach werden mit keimfrei gemachter Schere und Pinzette jeweils etwa haselnussgroße Teilproben entnommen und nach den im folgenden beschriebenen Verfahren verwendet.

Beim Ausstrich auf verschiedenen Nährbodenplatten kann diese Teilprobe wiederholt verwendet werden; es ist jedoch jeweils ein neuer Anschnitt vorzunehmen.

3.4

Direktes Ausstrichverfahren auf festen Nährmedien zur semiquantitativen Bestimmung des sonstigen Keimgehaltes

3.4.1

Nährmedium

Es wird mindestens ein einfacher Standard-Nährboden (zum Beispiel Pepton-Fleischextrakt-Agar) verwendet, der als handelsüblicher Fertignährboden erworben oder nach üblicher Laboratoriumspraxis hergestellt wird. Die verwendeten Platten sollten einen Durchmesser von etwa 10 cm haben. Ergänzend kann ein Dextrose-Blut-Agar oder ein anderer hinreichend erprobter im Handel erhältlicher fester Nährboden mit Blutzusatz eingesetzt werden.

3.4.2

Die nach Nummer 3.3 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber werden mit jeweils frischen Anschnitten auf jeweils mindestens einer halben Nährbodenplatte, die Teilprobe aus der Muskulatur auf einer ganzen Nährbodenplatte nach Nummer 3.4.1 ‑ jeweils unter Ausnutzung der verfügbaren Fläche ‑ ausgestrichen.

Die beimpften Nährbodenplatten sind bei +37 °C ±1 °C für mindestens 18 Stunden zu bebrüten. Nährböden mit Blutzusatz sind weitere 24 Stunden zu bebrüten.

3.4.3

Auswertung

Vor der Auswertung ist durch kritischen Vergleich aller angelegten Platten zunächst ein sekundärer Keimgehalt oder die Penetrationsflora von unsachgemäß angelieferten Proben auszuschließen. Letzteres ist bei der Mitteilung des Befundes zu berücksichtigen. Sofern nicht starker Keimgehalt den Nachweis langsamer wachsender Keime überdeckt, werden Nährböden mit Blutzusatz ggf. nach weiteren 24 Stunden Bebrütung erneut ausgewertet.

Das relevante Keimwachstum wird als

-

keimfrei (keine Koloniebildung),

-

schwach keimhaltig (bis zu 20 koloniebildende Einheiten) oder

-

stark keimhaltig (mehr als 20 koloniebildende Einheiten)

bewertet und im Untersuchungsbericht vermerkt.

Die Untersuchungsstelle hat ferner mitzuteilen, ob aufgrund des bakteriologischen Gesamtbefundes bei dem betreffenden Schlachttier zur Zeit der Schlachtung ein Einbruch von Bakterien in die Blutbahn und somit in den ganzen Schlachtkörper als Folge einer Erkrankung vorgelegen hat („Bakteriämie“). Sie hat auch mitzuteilen, wenn anzunehmen ist, dass ein starker Keimgehalt einzelner Proben auf eine Verunreinigung oder eine Penetration von Oberflächenkeimen (Einfluss der Beförderungsart und -dauer, unsachgemäße Probengröße oder Verpackung etc.) zurückzuführen ist.

3.5

Untersuchungen auf Rotlauf

3.5.1

Nährmedien

3.5.1.1

Natriumazid-Bouillon nachfolgender Zusammensetzung

20 g	Caseinpepton
5 g	Fleischextrakt
0,5 g	Natriumazid
1 000 ml	Aqua dest.

Die Lösung wird gut vermischt, auf einen pH-Wert von 7,8 ± 0,1 eingestellt, zu je 5 ml in Röhrchen abgefüllt und zweimal fraktioniert sterilisiert.

Als Grundlage kann auch eine andere laborübliche Nährbouillon mit einem Zusatz von 0,5 g Natriumazid je 1 000 ml verwendet werden. Als weiterer Zusatz kann Kanamycin eingesetzt werden.

3.5.1.2

Blut-Agar-Platten mit Zusatz von 1 % Glukose

3.5.2

Anreicherungsverfahren

Von den nach Nummer 3.3 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber sowie ggf. von weiterem eingesandten Probenmaterial (zum Beispiel Herzklappen oder Herzmuskulatur) werden etwa bohnengroße Stückchen in eine Natriumazid-Bouillon nach Nummer 3.5.1.1 gegeben. Die Bebrütung dieser Anreicherung erfolgt für 18 bis 24 Stunden bei +37 °C ±1 °C. Daran anschließend wird aus dieser Anreicherung je eine halbe Platte des Nährbodens nach Nummer 3.5.1.2 beimpft.

3.5.3

Direktausstrich

Die nach Nummer 3.3 gewonnenen Teilproben von Lymphknoten, Milz, Niere und Leber sowie ggf. weiteres eingesandtes Probenmaterial werden mit jeweils frischen Anschnitten zusätzlich auf jeweils mindestens einer halben Platte des Nährbodens nach Nummer 3.5.1.2 ‑ jeweils unter Ausnutzung der verfügbaren Fläche ‑ ausgestrichen.

3.5.4

Die nach Nummer 3.5.2 oder Nummer 3.5.3 beimpften Nährbodenplatten werden bei +37 °C ±1 °C bebrütet; sie werden nach 24 Stunden und ggf. erneut nach 48 Stunden auf das Vorkommen von feinen, hämolysierenden Kolonien geprüft.

Von verdächtigen Kolonien wird ein Objektträgerausstrich angefertigt, nach Gram gefärbt (vgl. Nummer 2.6) und mikroskopisch auf das Vorliegen charakteristischer Zellstrukturen untersucht.

3.6

Untersuchungen auf Salmonellen

3.6.1

Nährmedien und Seren

3.6.1.1

Anreicherungsmedien

3.6.1.1.1

Peptonwasser, gepuffert;

3.6.1.1.2

Tetrathionat-Bouillon;

3.6.1.1.3

Selenit-Bouillon;

3.6.1.1.4

Anreicherungsmedium nach Rappaport-Vassiliadis;

3.6.1.2

Feste Selektivnährböden

3.6.1.2.1

Brillantgrün-Phenolrot-Laktose-Saccharose-Agar;

3.6.1.2.2

eine weitere Selektiv-Indikatorplatte für Salmonellen nach Laboratoriumspraxis.

3.6.2

Untersuchung auf Salmonellen im Anreicherungsverfahren

3.6.2.1

In ein Gefäß mit 100 ml Anreicherungsflüssigkeit nach Nummer 3.6.1.1.2 oder Nummer 3.6.1.1.3 oder einem anderen Anreicherungsmedium nach jeweils neuestem wissenschaftlichen Erkenntnisstand werden Mengen von ca. 2 g aus jeder der unter Nummer 3.2.1.1 genannten Teilproben eines Schlachtkörpers nach grober Vorzerkleinerung mit der Schere zu einer Sammelanreicherung zusammengefügt. Die Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei +37 °C ±1 °C zu bebrüten. Falls die Untersuchung von zusätzlich eingesandten Proben (Verdachtsproben oder Proben von Tieren aus Ausscheiderbeständen oder von Serum- und Impfstofftieren) notwendig wird, ist eine zweite Anreicherung nur mit diesen Proben anzusetzen.

3.6.2.2

Handelt es sich bei den zu untersuchenden Proben um gefrorene, getrocknete oder in irgendeiner Form zubereitete Proben, zum Beispiel bei der Einfuhruntersuchung, ist eine Voranreicherung in 100 ml gepuffertem Pepton-Wasser (Nummer 3.6.1.1.1) für mindestens 6 Stunden bei +37 °C ±1 °C vorzuschalten; aus dieser wird ein Inokulum von 10 ml in die selektive Anreicherung entsprechend Nummer 3.6.2.1 übertragen. Diese Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei +37 °C ±1 °C zu bebrüten. Im Fall der Voranreicherung von Proben kann an Stelle der Tetrathionat- oder Selenit-Bouillon auch das Anreicherungsmedium nach Rappaport-Vassiliadis (Nummer 3.6.1.1.4) verwendet werden. Dann sind jedoch nur 0,1 ml der bebrüteten Voranreicherung in 10 ml dieses Mediums zu übertragen. Diese Anreicherung ist über mindestens 18 Stunden bei +42 °C ±1 °C zu bebrüten.

3.6.2.3

Im Anschluss an die unter Nummer 3.6.2.1 bzw. 3.6.2.2 genannte Bebrütung ist eine Subkultivierung vorzunehmen. Zu diesem Zweck werden mit einer Pipette vier Tropfen der Anreicherung auf eine erste Selektivplatte gebracht und sofort ausgespatelt. Der gleiche Spatel wird zur Beimpfung einer weiteren nach Nummer 3.6.1.2.2 ausgewählten Selektivplatte benutzt. Die Bebrütung des Plattensatzes erfolgt für 18 Stunden bei +37 °C ±1 °C.

3.6.3

Auswertung

3.6.3.1

Nach Beendigung der Bebrütungszeit sind die nach Nummer 3.6.2.3 aus der Anreicherung angelegten Subkultur-Platten auf das Wachstum von verdächtigen Kolonien zu untersuchen. Zur weiteren Abklärung sind fallweise serologische oder biochemische Verfahren oder die Phagentypisierung einzusetzen.

3.6.3.2

Nicht vollständig ausdifferenzierte, aber als Salmonellen erkannte Stämme, sowie der betreffende Stamm in einem unklar bleibenden Fall, sind zwecks Ermittlung des Salmonella-Serotyps an ein anerkanntes Referenzlaboratorium für Salmonellen zu senden.

3.6.3.3

Kann bei der serologischen Prüfung der Salmonella-Serotyp eindeutig ermittelt werden, wird dieser Befund im Untersuchungsbericht angegeben und dem Einsender mitgeteilt.

Bei allen nicht vollständig ausdifferenzierten, aber als Salmonellen erkannten Stämmen, kann die Diagnose „Salmonellen nachgewiesen“ gestellt und dem Einsender mitgeteilt werden. Das gleiche gilt für den Fall, dass sich bei der Prüfung des biochemischen Verhaltens die für Salmonellen typischen Reaktionen ergeben. Sofern ein Stamm zur Ermittlung des Salmonella-Serotyps an ein anerkanntes Referenzlaboratorium gesandt worden ist, wird dessen endgültige Diagnose in den eigenen Unterlagen vermerkt und dem Einsender nachträglich übermittelt.

3.7

Untersuchungen auf obligat anaerob wachsende grampositive Stäbchen (Clostridien)

3.7.1

Nährmedien

3.7.1.1

Leberbrühe nach Kelch oder Leber-Leber-Bouillon oder Hirn-Herz-Bouillon

Alternativ können auch andere vergleichbare flüssige Nährmedien verwendet werden (vgl. Nummer 3.1.4). Das Nährmedium wird zu je 10 ml in Reagenzgläser gefüllt und bereits bei der Herstellung mit einem geeigneten luftabdichtenden Pfropfen (zum Beispiel Paraffingemisch schüttfähig/flüssig im Verhältnis 2 : 1) versehen. Unmittelbar vor der Verwendung wird das Nährmedium zum Sieden gebracht.

3.7.1.2

Dextrose-Blut-Agar oder ein anderer hinreichend erprobter im Handel erhältlicher fester Nährboden

3.7.2

Herstellen eines anaeroben Milieus

Anaerobes Milieu wird durch das Zuführen eines Gasgemisches von 90 % N₂ + 10 % CO₂ in einem evakuierbaren Gefäß hergestellt. Das Gefäß sollte einmalig gespült werden, indem es mit dem Gasgemisch gefüllt, evakuiert und erneut mit dem Gasgemisch gefüllt wird. Die Anaerobiose kann in Anaerobiertöpfen auch chemisch-katalytisch mit geeigneten im Handel erhältlichen Sets herbeigeführt werden.

3.7.3

Bei pathomorphologischem Verdacht auf das Vorliegen einer Clostridien-Infektion ist ein direkter Ausstrich auf einer Nährbodenplatte nach Nummer 3.7.1.2 anzulegen und diese anaerob nach einem der unter Nummer 3.7.2 genannten Verfahren bei +37 °C ±1 °C für etwa 24 Stunden zu bebrüten.

3.7.4

Entsprechend dem unter Nummer 3.3 beschriebenen Verfahren wird eine bohnengroße Teilprobe aus der Tiefe der Muskulatur entnommen und in ein Röhrchen mit siedend heißer Leberbrühe (oder einem anderen Nährmedium) eingegeben. Dabei ist die luftabdichtende Paraffinschicht schnell zu durchstoßen. Die Bebrütung erfolgt für mindestens 18 Stunden bei +37 °C ±1 °C.

3.7.5

Bei einer durch deutliche Lageveränderung des luftabschließenden Paraffinpfropfens erkennbaren Gasbildung ist wie folgt zu verfahren:

3.7.5.1

Aus dem Inhalt eines jeden Röhrchens mit erkennbarer Gasbildung wird ein Objektträgerausstrich angefertigt, nach Gram gefärbt (vgl. Nummer 2.6) und mikroskopisch durchmustert. Dazu wird das betroffene Röhrchen über dem Bunsenbrenner unter Schräghaltung so erhitzt, dass der Paraffinpfropfen teilweise verflüssigt und die Bouillonkultur zugänglich wird. Werden ausschließlich oder überwiegend gramnegative, nicht sporenbildende Stäbchen oder Kokken festgestellt, ist die Untersuchung beendet und das Ergebnis als negativ zu bezeichnen.

3.7.5.2

Bei Nachweis von grampositiven oder gramlabilen Stäbchen ohne oder mit Sporenbildung oder von gramnegativen Stäbchen mit Sporenbildungstendenz erfolgt die Anlage einer Subkultur, indem je ein Tropfen der fraglichen Flüssigkultur auf zwei festen Nährböden nach Nummer 3.7.1.2 gleichmäßig mit Öse oder Spatel ausgestrichen wird.

Die beimpften Platten werden bei +37 °C ±1 °C für etwa 24 Stunden bebrütet; dabei wird eine Platte aerob, die andere anaerob nach einem der unter Nummer 3.7.2 genannten Verfahren gehalten.

3.7.5.3

Auswertung des Direktausstriches und der Subkulturen

Die Direktausstriche nach Nummer 3.7.3 werden auf das Vorliegen verdächtiger Kolonien geprüft. Von diesen sind Ausstriche zu fertigen, nach Gram zu färben und mikroskopisch auf das Vorliegen grampositiver oder gramlabiler Stäbchen mit oder ohne Sporenbildung zu prüfen. Nach der Bebrütung der Subkulturen folgt eine vergleichende Bewertung des Wachstums auf den beiden parallel angelegten Nährböden zur Feststellung eventuell vorhandener obligat anaerober Keimflora-Anteile. Von solchen Anteilen einer Mischkultur werden Ausstrichpräparate in ausreichender Zahl, mindestens von je drei Kolonien, gefertigt, nach Gram gefärbt und mikroskopisch auf das Vorliegen grampositiver oder gramlabiler Stäbchen mit oder ohne Sporenbildung geprüft. Entsprechend dem Ausgang dieser mikroskopischen Untersuchung wird das Ergebnis im Untersuchungsbericht unter Nennung der Art der Kultivierung (Direktausstrich oder über Anreicherung) als „positiv“ oder „negativ“ angegeben.

3.7.5.4

Bei Verdacht auf toxinogene Spezies oder Bakteriämieerreger sind weitere Identifizierungsversuche einzuleiten.

3.8

Sofern Krankheitserreger gefunden worden sind, hat die Untersuchungsstelle dieses Ergebnis auf dem schnellsten Wege vorab (ggf. fernmündlich, mit E-Mail, Telefax oder anderen Mitteln der elektronischen Datenübertragung) und außerdem noch schriftlich der im Antragsvordruck bezeichneten Stelle mitzuteilen. Dies gilt auch für den Fall, dass solche Bakterien zwar nicht nachgewiesen sind, aber den Umständen nach (zum Beispiel Fehlen wichtiger Organe, Eingang nicht mehr verwertbaren Probenmaterials oder bei örtlichem Milzbrand des Schweines) das Freisein des Schlachtkörpers von solchen Keimen trotzdem nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden kann. Ein Exemplar des ausgefüllten Vordruckes ist mindestens drei Jahre aufzubewahren.

3.9

Untersuchung auf Hemmstoffe in Muskulatur, Niere und Leber

3.9.1

Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode beschreibt ein mikrobiologisches Verfahren zum Nachweis antibakteriell wirksamer Stoffe (Hemmstoffe) in Muskulatur und Niere, bei Geflügel in Muskulatur und Leber. Die Untersuchung auf Hemmstoffe mit dem hier beschriebenen Verfahren kann ein „positives“, „negatives“ oder „zweifelhaftes“ Ergebnis erbringen. Beim Nachweis des Vorhandenseins eines Hemmstoffes ist dessen Identifizierung oder Quantifizierung nur eingeschränkt möglich.

3.9.2

Kurzbeschreibung

Proben von Muskulatur, Nieren- oder Lebergewebe werden auf einen festen Nährboden gelegt, der eine hemmstoffempfindliche Bakterienkultur in bestimmter Konzentration enthält. Hemmstoffe diffundieren während der Bebrütung des Testsystems in den Nährboden und verursachen in der Umgebung der Proben eine Wachstumshemmung. Die Größe des Hemmhofes ist ein Maß für den Hemmeffekt. Stark keimhaltiges, gefrorenes oder erkennbar zersetztes Untersuchungsmaterial ist für die Untersuchung auf Hemmstoffe ungeeignet.

3.9.3

Chemikalien

3.9.3.1

Nährboden

Zur Nährbodenherstellung wird ein Trockennährboden folgender Zusammensetzung verwendet:

3,45 g	Fleischpepton4)
3,45 g	Caseinpepton5)
5,1 g	NaCl
13,0 g	Agar
1 000 ml	Aqua dest.

Der Trockennährboden ist in frisch destilliertem oder voll entsalztem Wasser aufzulösen, zur Pufferung ist 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) hinzuzufügen. Für den Dreiplattentest sind Nährböden mit pH-Werten von 6,0, 7,2 und 8,0 herzustellen. Die Einstellung des pH-Wertes hat mit 0,1 N HCl oder mit 0,1 N NaOH zu erfolgen. Der pH-Wert des fertigen Nährbodens ist nach dem Autoklavieren zu überprüfen. Zur Vorbereitung des Nährbodens für den Hemmstofftest werden 500 ml des verflüssigten und auf +50 °C abgekühlten fertigen Nährbodens mit 0,5 ml einer Sporensuspension nach Nummer 3.9.4.1.1 unter Schütteln gleichmäßig vermischt. Dem auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellten Nährboden werden außerdem 0,5 ml der in Nummer 3.9.3.2 genannten Gebrauchslösung von Trimethoprim zugesetzt und durch Schütteln mit dem Nährboden gleichmäßig vermischt. In jeweils eine Petrischale von 90 mm Durchmesser sind ca. 11 ml des beimpften Nährbodens (Agars) gleichmäßig auszugießen. Bei einem abweichenden Durchmesser der Petrischalen sind die Volumina anzupassen. Nach dem Erstarren des Nährbodens sind die Petrischalen unverzüglich auf +3 bis +5 °C zu kühlen und bis zur Benutzung bei dieser Temperatur zu lagern. Die vorbereiteten Testplatten sollten innerhalb einer Woche nach der Herstellung verwendet worden sein.

3.9.3.2

Trimethoprimlösung

10 mg Trimethoprim (TMP) werden in 10 ml Ethanol unter Schütteln bei +50 °C gelöst (Stammlösung). Diese Lösung ist bei kühler und dunkler Aufbewahrung mehrere Monate haltbar. Durch Zugabe von 190 ml sterilem Aqua dest. wird die Lösung auf eine Konzentration von 50 µg Trimethoprim/ml eingestellt (Gebrauchslösung). Die Haltbarkeit dieser Lösung beträgt bei Kühllagerung mindestens 14 Tage.

3.9.4

Testkeim und Testblättchen

3.9.4.1

Testkeim

Als Testkeim ist Bacillus subtilis BGA zu verwenden. Er ist vom Bundesinstitut für Risikobewertung, Postfach 33 00 13, 14191 Berlin, oder vom Fachhandel zu beziehen.

Die abgebenden Stellen haben Wachstumseigenschaften und Resistenzverhalten des Testkeims gegenüber verschiedenen antimikrobiell wirksamen Stoffen regelmäßig zu überprüfen. Hierfür ist eine Kontrolle nach Nummer 3.9.4.1.2 vorzunehmen.

3.9.4.1.1

Sporensuspension

Die Sporensuspension kann in den Untersuchungsstellen hergestellt oder gebrauchsfertig vom Fachhandel bezogen werden.

Zur Herstellung der Sporensuspension wird ein Nährboden mit der in Nummer 3.9.3.1 genannten Zusammensetzung auf einen pH-Wert von 7,0 ±0,2 eingestellt und nach massiver Ösenbeimpfung oder durch Überschichten mit 1 ml einer Keimsuspension mit dem in Nummer 3.9.4.1 genannten Testkeim 10 Tage bei +30 °C bebrütet. Danach wird der Testkeim mit steriler physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt. Die Abschwemmung wird 10 Minuten bei 3 000 U/min zentrifugiert; anschließend wird der Überstand abgegossen, dem Sediment nochmals sterile physiologische NaCl-Lösung zugegeben und abermals 10 Minuten bei 3 000 U/min zentrifugiert. Nach erneutem Abgießen des Überstandes wird sterile physiologische NaCl-Lösung zugegeben und die Suspension 30 Minuten bei +70 °C erhitzt. Die so gewonnene Sporensuspension wird auf eine Dichte von ca. 10⁷ Sporen/ml eingestellt (Gebrauchssporensuspension). Sie ist bei Kühlschranktemperatur (+3 bis +5 °C) mehrere Wochen haltbar. Die Überprüfung der Dichte erfolgt als kulturelle Keimzählung im Oberflächenverfahren auf dem nach Satz 2 hergestellten Nährboden. Wird zur Herstellung der Suspension eine Bakterienkultur verwendet, die in der Untersuchungsstelle über mehrfache Passagen kultiviert worden ist, so ist spätestens nach jeder fünften Passage eine Überprüfung nach Nummer 3.9.4.1.2 vorzunehmen. Ist dies nicht möglich, ist eine neue Kultur des Testkeimes von den in Nummer 3.9.4.1 genannten Stellen zu verwenden.

3.9.4.1.2

Sensibilitätsprüfung und Identitätsprüfung des zu verwendenden Testkeimes

Bei mehrfachen Subkultivierungen von Bac. subtilis BGA ist eine Sensibilitäts- und Identitätsprüfung des Teststammes durchzuführen. Vor einer Identifizierung ist in jedem Fall zu prüfen, ob eine Reinkultur vorliegt oder darüber.

3.9.4.1.2.1

Sensibilitätsprüfung des Testkeimes

Zur Sensibilitätsprüfung des verwendeten Testkeim-Stammes werden Testblättchen mit den in der Tabelle 1 angegebenen Wirkstoffen getränkt und auf einen vorbereiteten Nährboden gelegt. Die Hemmzonen eines sensiblen Teststammes liegen im angegebenen Bereich.

Tabelle 1:

Wirkstoffe zur Sensibilitätsprüfung von Bac. subtilis BGA

Wirkstoff	aufzutragende Menge/Testblättchen	Einsatz auf Testplatte [pH]	Hemmhof
Penicillin G	0,01 IE	6,0	5 - 10 mm
Sulfadimidin	0,5 µg	7,2*)	9 - 14 mm
Dihydrostreptomycin	0,5 µg	8,0	5 - 10 mm
Furazolidon	1 µg	6,0	9 - 11 mm
Chlortetracyclin	0,01 µg	6,0	7 - 9 mm
Erythromycin	0,1 µg	8,0	7 - 9 mm
Spiramycin	1 µg	8,0	7 - 9 mm
Enrofloxacin	0,1 µg	8,0	8 - 10 mm

3.9.4.1.2.2

Identitätsprüfung des Testkeimes

Zur Identitätsprüfung des verwendeten Testkeim-Stammes können ausgewählte Tests für die biochemische Differenzierung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus herangezogen werden (siehe Tabelle 2). Zellen aus einer 18 bis 24 Stunden alten Kultur von Bac. subtilis BGA sind beweglich; im Grampräparat sind ovale Sporen mit nicht angeschwollenen Mutterzellen zu sehen.

Tabelle 2:

Identitätsprüfung von Bac. subtilis BGA durch ausgewählte biochemische Tests

Test	Bewertung nach (Tagen)	Bemerkungen bzw. Zugabe weiterer Reagentien	Auswertung (positives Ergebnis bei)	Biochem. Eigenschaften von Bac. subtilis BGA
Voges-Proskauer-Reaktion	1, 3, 7	zu 0,5 ml Bakteriensuspension 0,3 ml α-Naphthol und 1 ml KOH	Rotfärbung	+
Citratverwertung	14	Schrägagar	Rotfärbung	+
Wachstum bei +60 °C und +65 °C	3	Flüssigkultur bei +60 °C vorwärmen	Trübung	ø
Gasbildung aus Glukose	7, 14	Einsatz eines Durham-Röhrchens	Gasbildung im Durham-Röhrchen	ø
Indolbildung	max. 14	zu 0,5 ml ein Tropfen Kovacs-Reagenz	roter Ring auf der Oberfläche	ø
Lecithinasebildung	1, 3, 7	Eigelb Nähragar	Ringbildung auf der Oberfläche	ø
Anaerobes Wachstum	3, 7		Wachstum	ø
Wachstum in 7 % NaCl	7, 14	Bouillon schräg bebrüten	Trübung	+
Stärkehydrolyse	3, 5	Lugol’sche Lösung (20 %) auf den Agar fluten	farbige Zone um die Kolonie	+
Kaseinhydrolyse	max. 7	Casein-Milchagar	klare Zone um die Kolonie	+

3.9.4.2

Testblättchen

Als Testblättchen werden handelsübliche Erzeugnisse mit einem Durchmesser von etwa 6 mm, beladen mit 0,01 IE Penicillin G (für Nährboden pH 6,0), 0,5 µg Streptomycin (für Nährboden pH 8,0) oder 0,5 µg Sulfadimidin (für Nährboden pH 7,2), eingesetzt. Stehen gebrauchsfertige Blättchen nicht zur Verfügung, können Blättchen aus Schleicher #amp;# Schüll-Papier Nr. 2668 selbst hergestellt und beladen werden.

3.9.5

Geräte und Hilfsmittel

3.9.5.1

Probenstanzgerät, Pinzette, Schere;

3.9.5.2

Lupe, besser Stereomikroskop, mit einer Einrichtung zur Hemmhofausmessung;

3.9.5.3

Brutschrank, +30 °C ±1 °C.

3.9.6

Probenahme

Bei der Untersuchung auf Hemmstoffe können die nach Nummer 3.2.1 für eine bakteriologische Untersuchung entnommenen Proben verwendet werden. Anderenfalls sind zu entnehmen:

3.9.6.1

aus einem Vorder- oder Hinterviertel eines geschlachteten Tieres möglichst ein ganzer, von Faszien umschlossener Muskelbauch oder ersatzweise ein Muskelwürfel von etwa 6 cm Seitenlänge; von der Entnahme und Untersuchung einer Muskelprobe von in Anhang I Nummer 1.2 bis 1.4 und 1.6 der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 genannten Schlachttieren kann auf Antrag des Verfügungsberechtigten zunächst abgesehen werden; Entnahme und Untersuchung sind jedoch nachzuholen, wenn die Untersuchung auf Hemmstoffe in der Niere ein zweifelhaftes oder positives Ergebnis hatte;

3.9.6.2

eine Niere oder bei Geflügel die Leber;

3.9.6.3

Entnahme und Transport der Proben sind nach Nummer 3.2.3 vorzunehmen.

3.9.7

Durchführung

Aus der Muskulatur sowie aus dem Nierenmark oder der Leber sind je drei zylinderförmige Gewebestücke mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von etwa 2 mm auszustanzen. Je ein Gewebestück der Niere oder der Leber und der Muskulatur sind auf je einen vorbereiteten Nährboden von pH = 6,0, pH = 8,0 und pH = 7,2 (letzterer mit Trimethoprimzusatz) aufzulegen. Die mit den Proben beschickten Testplatten sowie die mit Testblättchen nach Nummer 3.9.4.2 beschickten Kontrollplatten sind 18 bis 24 Stunden bei +30 °C ±1 °C zu bebrüten.

3.9.8

Auswertung

Vor der Auswertung der mit den Proben beschickten Testplatten sind zunächst die Kontrollplatten zu prüfen. Die weitere Auswertung kann nur vorgenommen werden, wenn die gleichzeitig angesetzten Kontrollplatten einwandfreie Hemmzonen zeigen, deren Breiten den Angaben in Tabelle 1 entsprechen. Die Hemmzonenbreite zwischen dem Rand eines Gewebezylinders und der Wachstumsgrenze des Testkeimes wird ausgemessen. In Zweifelsfällen hat dies unter Zuhilfenahme einer Lupe oder eines Mikroskops zu geschehen. Eine vollständige Wachstumshemmung mit einer auf der Nährbodenoberfläche durchgehenden Hemmzone von mindestens 2 mm ist als positiv, eine solche von weniger als 2 mm, aber mehr als mindestens 1 mm, als zweifelhaft anzusehen.

3.9.9

Eintragung und Mitteilung des Ergebnisses der Untersuchung auf Hemmstoffe

3.9.9.1

Nach abgeschlossener Untersuchung auf Hemmstoffe sind durch die Untersuchungsstelle die vorgesehenen Abschnitte des Antragsvordrucks auszufüllen. Hierbei ist zum Ausdruck zu bringen, ob das Ergebnis der Untersuchung positiv, negativ oder zweifelhaft ist. Der ausgefüllte Vordruck ist mindestens drei Jahre aufzubewahren.

3.9.9.2

Die Untersuchungsstelle hat das Ergebnis der Untersuchung auf Hemmstoffe auf dem schnellsten Wege (zum Beispiel fernmündlich, mit E-Mail, Telefax oder anderen Mitteln der elektronischen Datenübertragung) und außerdem schriftlich der im Antragsvordruck bezeichneten Stelle mitzuteilen. Dies gilt insbesondere, wenn nach Nummer 3.9.6.1 Satz 2 zunächst auf die Entnahme einer Muskelprobe verzichtet worden ist. Sofern ein starker Keimgehalt, ein Gefrierprozess oder fortgeschrittene Zersetzungsprozesse einzelner Proben die Untersuchung auf Hemmstoffe oder deren Auswertung unmöglich gemacht haben, ist der Einsender darauf hinzuweisen.

3.9.10

Validierung

Gemäß der Entscheidung 2002/657/EG der Kommission vom 14. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen (ABl. L 221 vom 17.8.2002, S. 8) in der jeweils geltenden Fassung sind Leistungskriterien sowie sonstige Anforderungen und Verfahren für Analysemethoden festzulegen. Die Validierung nach Artikel 3 in Verbindung mit Anhang I der Entscheidung 2002/657/EG muss nachweisen, dass die Analysemethode die für die ausgewählten Leistungsmerkmale gültigen Kriterien erfüllt. Die Validierungsdaten im Sinne des Anhangs I Nummer 2 der Entscheidung 2002/657/EG müssen vor dem Einsatz des Dreiplatten-Hemmstofftests als Screeningmethode ermittelt werden und im Labor vorliegen. Der Aufwand für eine umfassende Validierung dieses Testverfahrens ist erheblich und kann nicht von jedem Routinelabor, das den Dreiplatten-Hemmstofftest durchführt, geleistet werden. Aus diesem Grund ist ein zweistufiges Verfahren anzuwenden:

3.9.10.1

Durchführung der ersten Stufe der Validierung in einem zuständigen Labor

Die erste Stufe der Validierung ist in einem Labor, das umfangreiche Kenntnisse in der Validierung nach der Entscheidung 2002/657/EG mittels statistischer Versuchsplanung besitzt, durchzuführen. Bei dem Dreiplatten-Hemmstofftest als qualitativer Screeningmethode im Sinne des Anhangs I Nummer 1.35 der Entscheidung 2002/657/EG sind im Rahmen der Validierung des Dreiplatten-Hemmstofftests in dem zuständigen Labor mindestens folgende Leistungsmerkmale nach Anhang I Nummer 1.19 der Entscheidung 2002/657/EG zu überprüfen:

-

die Spezifität/Selektivität/Anwendbarkeit im Sinne des Anhangs I Nummer 1.37,

-

das Nachweisvermögen (CC-beta) im Sinne des Anhangs I Nummer 1.12 sowie

-

die Robustheit im Sinne des Anhangs I Nummer 1.33

der Entscheidung 2002/657/EG.

Hierbei sind alle relevanten Validierungsparameter unter Einbeziehung von Einflussfaktoren, die die Messergebnisse beinträchtigen können, zu ermitteln. Bei der Überprüfung der genannten Leistungsmerkmale sind die Stoffgruppen nach Anhang I Gruppe B Nummer 1 der Richtlinie 96/23/EG als Substanzen zu berücksichtigen. Als Matrices sind Muskulatur und Niere von Tieren nach Anhang I Nummer 1.2, 1.4 oder 1.6 oder Muskulatur und Leber von Tieren nach Anhang I Nummer 1.3 der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 zu verwenden.

Die Ergebnisse der ersten Stufe der Validierung sind den Routinelaboratorien zeitnah zur Verfügung zu stellen.

3.9.10.1.1

Bestimmung der Spezifität/Selektivität/Anwendbarkeit

Die Nachweisempfindlichkeit und Spezifität bzw. Selektivität des Dreiplatten-Hemmstofftests ist für jede Substanz einzeln zu ermitteln. Eine Liste der zu untersuchenden Matrices und Substanzen wird vom Nationalen Referenzlabor für Rückstände von pharmakologisch wirksamen Stoffen beim Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit zur Verfügung gestellt. Sofern noch keine Daten für einzelne Substanzen bekannt sind, wird die entsprechende Matrix zunächst auf verschiedenen Konzentrationsstufen unter- und oberhalb der Rückstandshöchstmenge entsprechend der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 des Rates vom 26. Juli 1990 zur Schaffung eines Gemeinschaftsverfahrens für die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs (ABl. L 224 vom 18.8.1990, S. 1) dotiert.

Dies erfolgt in einem dreifachen Ansatz, wobei entweder Agarstanzlöcher oder Testblättchen (abhängig von den Ergebnissen der Vorversuche) zu verwenden sind. Als positives Ergebnis wird eine Hemmhofbreite >2 mm gewertet. Stoffe sind möglichst ab einer Konzentration von 0,5 x Rückstandshöchstmenge MRL (Maximum Residue Limit) sicher zu erfassen. Sollte sich im Ergebnis dieser Untersuchungen zur Anwendbarkeit herausstellen, dass eine Reihe von Substanzen bei der jeweiligen MRL-Konzentration mit dem Dreiplatten-Hemmstofftest nicht nachzuweisen sind, sind Probenextrakte zu verwenden (Pietsch, K. et al., 1997)⁶⁾. Dazu wird aus einer definierten Gewebemenge mit einem Lösungsmittel ein Extrakt gewonnen, der durch Einengen zur Aufkonzentrierung der Substanz führt und so den Nachweis mit dem Dreiplatten-Hemmstofftest gestattet. Da das Verfahren der Extraktgewinnung mit einem höheren analytischen Aufwand verbunden ist, wird dies nur bei Substanzen angewendet, bei denen das Nachweisvermögen des Dreiplatten-Hemmstofftests zu gering ist und andere Verfahren zu aufwändig wären. Die Methodenbeschreibung für die Extraktgewinnung erfolgt gesondert.

3.9.10.1.2

Bestimmung des Nachweisvermögens (CC-beta)

Hierzu werden 20 Proben je Substanz auf allen drei Testplatten bei der MRL-Konzenration untersucht. Dabei darf der ß-Fehler (falsch negative Ergebnisse) 5 % nicht übersteigen. Ist diese Vorgabe erfüllt, entspricht die MRL-Konzentration dem Nachweisvermögen (CC-beta). Für den Nachweis dieser Substanzen, die bei der MRL-Konzentration nicht nachgewiesen werden können, müssen die Proben bzw. deren Gewebesäfte während der Probenvorbereitung durch Extraktion nach Nummer 3.9.10.1.1 konzentriert werden.

3.9.10.1.3

Prüfung der Robustheit/Anwendbarkeit

Zur Reduzierung der erforderlichen Untersuchungszahlen ist der Robustheitstest unter Verwendung statistischer Versuchspläne, wie sie im Programm zur Methodenoptimierung und -validierung vorgegeben werden, durchzuführen. Dazu werden nachfolgende Faktoren (Tabelle 1) auf jeweils zwei Stufen variiert und deren Effekte auf die Ergebnisse beurteilt. Die Auswahl der Faktoren kann nach dem Stand des Wissens angepasst werden. Das Programm erstellt einen Probenplan mit vorgegebenen Faktoren-Kombinationen, die in 11facher Ausführung auf verschiedenen Konzentrationsniveaus auf jeder Test-Platte untersucht werden. Dazu wird jeweils in 11fachem Ansatz Gewebesaft auf Testblättchen bzw. in Agarstanzlöchern dem Hemmstofftest mit einer Faktoren-Kombination unterzogen. Dieser Test ist mit ausgewählten Antibiotika durchzuführen.

Tabelle 1:

Zu untersuchende Faktoren

	Testplatten
Faktoren (Vorgaben des Dreiplatten-Hemmstofftests)	pH 6,0	pH 7,2	pH 8,0
Inkubationszeit	18 h/24 h	18 h/24 h	18 h/24 h
Inkubationstemperatur (+30 °C ±2 °C)	+28 °C / +32 °C	+28 °C / +32 °C	+28 °C / +32 °C
Schichtdicke (2 mm): über Ausgieß-Volumen → Hemmhofbreite	2 mm/4 mm	2 mm/4 mm	2 mm/4 mm
pH-Wert (±0,5)	pH 5,5 / pH 6,5	pH 6,7 / pH 7,7	pH 7,5 / pH 8,5
Zeit zwischen Auflegen auf Agar und Beginn der Bebrütung	5 min/15 min	5 min/15 min	5 min/15 min
Agar-Chargen	2 verschiedene	2 verschiedene	2 verschiedene
Probenauftrag	Testblättchen/ Agarstanz-löcher	Testblättchen/ Agarstanz-löcher	Testblättchen/ Agarstanz-löcher

Die Breiten der entstandenen Hemmhöfe werden ausgemessen und ein Mittelwert der Hemmhofbreiten der 11 Parallel-Ansätze errechnet. Die Ergebnisse werden zur Auswertung in das Programm eingegeben. Die Auswertung zeigt, welche Faktoren einen Einfluss auf die Robustheit der Methode haben. Diese Faktoren sind bei der Durchführung des Hemmstofftests zu definieren und zu beachten.

3.9.10.1.4

Prüfung der Stabilität der Substanzen in der Matrix

Zur Überprüfung der Stabilität der Substanzen in der Matrix während der Lagerung (nach der Probenahme bis zur Durchführung des Dreiplatten-Hemmstofftests) werden mit ausgewählten Substanzen eine Anzahl von dotierten Matrixproben hergestellt. Diese werden unter den in Tabelle 2 angegebenen Bedingungen gelagert und anschließend mit dem Dreiplatten-Hemmstofftest untersucht.

Tabelle 2:

Lagerung von Matrixproben

Lagerung/Zeit	7 Tage	4 Tage	1 Tag	12 h	3 h	0,5 h
-30 °C	3	3	3	3	0	0
+4 bis +6 °C	0	3	3	3	3	0
Raumtemperatur	0	0	3	3	3	3

3.9.10.2

Durchführung der zweiten Stufe der Validierung (Routinelabor)

Die zweite Stufe der Validierung dient der Überprüfung der ermittelten Validierungsparameter der ersten Stufe unter den Bedingungen im jeweiligen Routinelabor. Sie ist in jedem Labor, das den Dreiplatten-Hemmstofftest anwendet, durchzuführen.

Die zweite Stufe der Validierung umfasst folgende Überprüfungen des Dreiplatten-Hemmstofftests:

-

Spezifität,

-

Nachweisempfindlichkeit und

-

Nachweisvermögen.

Zur Überprüfung der Leistungsmerkmale Nachweisempfindlichkeit und Nachweisvermögen werden in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Validierung der ersten Stufe besonders relevante Substanzen, mindestens jedoch jeweils ein Wirkstoff der Gruppe Sulfonamide, Penicilline und Aminoglykoside, ausgewählt. (Vorbehaltlich der Ergebnisse der Validierung der ersten Stufe sind von den Routinelaboratorien in der Regel keine Untersuchungen zur Robustheit oder zur Stabilität in der Matrix durchzuführen.)

3.9.10.2.1

Bestimmung der Spezifität

Zur Überprüfung der Spezifität des Dreiplatten-Hemmstofftests sind positive Hemmstoffproben regelmäßig durch chemisch-analytische Nachweisverfahren abzusichern.

3.9.10.2.2

Bestimmung der Nachweisempfindlichkeit

Die ausgewählten Substanzen sind auf einer Konzentrationsstufe in 6fach-Untersuchungen zu überprüfen. Das Niveau der zu überprüfenden Wirkstoff-Konzentration ist unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Validierung der ersten Stufe festzulegen.

3.9.10.2.3

Bestimmung des Nachweisvermögens

Das Nachweisvermögen des Dreiplatten-Hemmstofftests ist in Abhängigkeit von den Ergebnissen der Validierung der ersten Stufe für besonders relevante Substanzen, mindestens jedoch für jeweils einen Sulfonamid-, einen Penicillin- und einen Aminoglykosid-Wirkstoff nach Nummer 3.9.4.1.2.1 auf einer Konzentrationsstufe, zum Beispiel in 20fach-Untersuchungen, zu überprüfen. Das Niveau der zu überprüfenden Konzentration wird unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Validierung der ersten Stufe festgelegt.

3.9.10.3

Wiederholung der Validierung

Die Überprüfung nach Nummer 3.9.10.1 und 3.9.10.2 ist zu wiederholen, sofern signifikante Abweichungen bezüglich der betreffenden Leistungsmerkmale auftreten.

4.

Messung des pH-Wertes in Schlachtkörpern

4.1

Zweck und Anwendungsbereich

Ein erheblich abweichender pH-Wert erlaubt Aussagen über die Haltbarkeit des Fleisches. Zur Beurteilung einer abweichenden Fleischbeschaffenheit sind auch die Ergebnisse anderer Untersuchungen (zum Beispiel Kochproben, Prüfung des Wasserbindungsvermögens) heranzuziehen. Die unter Nummer 4.4 genannten Richtwerte allein reichen nicht zur Beurteilung einer abweichenden Fleischreifung aus.

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Messung des pH-Wertes in Schlachtkörpern von Schlachttieren - außer von Geflügel - und erlegtem Haarwild. Ihr liegt die Methode L 06.00-2 „Messung des pH-Wertes in Fleisch und Fleischerzeugnissen“ der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG zugrunde.

Ergänzend zu dieser Methode ist bei der Messung in Schlachtkörpern Folgendes zu beachten:

4.2

Messstellen und Messung

Der pH-Wert wird

-

ca. 5 cm vom kaudalen Ende der Beckensymphyse („Schloss“) im Winkel von 120° oberhalb der Symphyse (beim Schwein: M. semimembranosus, beim Rind: M. adductor);

-

im M. longissimus dorsi zwischen dem 13. und dem 14. Dornfortsatz der Brustwirbelsäule in der Tiefe des Muskels ermittelt.

4.2.1

Vorbereitung der Messstellen

Vor Einstich der Messelektrode ist ggf. ‑ insbesondere bei Zugang von der Körperoberfläche her und bei stark gekühlten Schlachtkörpern ‑ mit einem geeigneten Instrument (Dorn, Messer) vorzustechen. Zur Messung des pH-Wertes im M. semimembranosus bzw. im M. adductor ist ein Teil dieses Muskels freizulegen, um die Messelektrode einzuführen.

4.2.2

Messung

4.2.2.1

Die Elektroden werden in den Muskel eingestochen. Dabei ist darauf zu achten, dass ein einwandfreier Kontakt (Glasmembran und Diaphragma) mit dem Muskelfleisch hergestellt ist und die Elektrodenspitze stets nach unten zeigt, damit der Kontakt des Elektrolyts mit der Glasmembran erhalten bleibt. Luftblasen in der Elektrodenspitze sind durch vorsichtiges Schütteln zu entfernen. Das Temperaturpotentiometer des pH-Messgerätes wird auf die Temperatur des Fleisches eingestellt. Nach Erreichen der Anzeigekonstanz wird der pH-Wert mit zwei Stellen nach dem Komma abgelesen. Die Messung wird an derselben Stelle wiederholt. Die Messung wird zunächst an einer Schlachthälfte vorgenommen. Im Verdachtsfall ist die andere Hälfte auf die gleiche Weise zu untersuchen.

4.2.2.2

Zur Ermittlung einer abnormen Fleischsäuerung (siehe Nummer 4.4) sind Messungen vorzunehmen

-

bei allen Schlachtkörpern 45 Minuten nach der Schlachtung (pH₁) und

-

bei Schwein und Schaf 24 Stunden bzw. beim Rind 48 Stunden nach der Schlachtung sowie bei Haarwild innerhalb von 12 bis 96 Stunden nach dem Erlegen (pH_ULT).

4.3

Auswertung

Aus den ermittelten Messwerten wird der arithmetische Mittelwert gebildet. Der pH-Wert wird auf eine Stelle nach dem Komma gerundet angegeben.

4.4

Richtwerte für abnorme Fleischsäuerung

4.4.1

Beschleunigte Glykolyse liegt vor, wenn als Messwert pH₁

-

beim Schwein 5,6 oder niedriger (im M. longissimus dorsi) bzw. 5,8 oder niedriger (im M. semimembranosus),

-

beim Rind 6,0 oder niedriger,

-

beim Schaf 5,8 oder niedriger

ermittelt wird;

4.4.2

verzögerte oder unvollständige Glykolyse liegt vor, wenn als Messwert pH_ULT

-

beim Schwein 6,2 oder höher,

-

beim Rind 6,2 oder höher,

-

beim Schaf 6,4 oder höher,

-

beim Haarwild (außer bei Hasen oder Wildkaninchen) 5,8 oder höher,

-

bei Hasen 6,4 oder höher,

-

bei Wildkaninchen 6,2 oder höher

ermittelt wird.

5.

Bestimmung der auspressbaren Gewebeflüssigkeit aus Muskelproben

5.1

Zweck und Anwendungsbereich

Mit einem definierten Druckverfahren wird die Menge der austretenden Gewebeflüssigkeit, die mit standardisiertem Filterpapier aufgefangen wird, festgestellt. Eine große auspressbare Flüssigkeitsmenge weist auf eine geringe Wasserbindung des Fleisches von Schlachttieren - außer von Geflügel - hin; darüber hinaus kann der Grad der Ausblutung beurteilt werden. Zur Beurteilung einer abweichenden Fleischbeschaffenheit sind auch die Ergebnisse anderer Untersuchungen (zum Beispiel Kochproben, pH-Wert-Messung) heranzuziehen.

5.2

Geräte und Hilfsmittel

5.2.1

Plexiglaskompressorium mit Druckhebelmechanismus („Braunschweiger Gerät“).

Es besteht aus einem Metallrahmen mit Druckhebel und zwei Plexiglasplatten;

5.2.2

Filterpapier (60 mm x 60 mm) mit definierter Saugfähigkeit⁷⁾;

5.2.3

Schere und Pinzette;

5.2.4

Feiner Filzstift mit wasserunlöslicher Farbe oder Kopierstift;

5.2.5

Silikonscheibe (Durchmesser: 16 mm; Dicke: 2 mm)⁸⁾ und Kontrollschablone (Klarsichtfolie) zur Überprüfung des Pressdruckes des Gerätes;

5.2.6

Auswerteschablone zur Bestimmung der Flüssigkeits- und Fleischflächenränder, bestehend aus 15 Kreisen definierter Durchmesser auf durchsichtiger Kunststofffolie (siehe Muster nach Nummer 5.6).

5.3

Untersuchungsmaterial

Aus dem zu untersuchenden Fleischstück (bei Schlachtkörpern: M. semimembranosus (Schwein) bzw. M. adductor (Rind) sowie M. longissimus dorsi) werden an zwei Stellen mit Schere und Pinzette Muskulaturstückchen ohne Fett- und Bindegewebe in einer Menge von mindestens 2 g entnommen. Bei abgetrockneten Oberflächen sind die Proben aus der Tiefe des Gewebes zu entnehmen.

5.4

Durchführung

Die Untersuchungen sind unmittelbar im Anschluss an die Probenahme (Q₁ = Messwert nach einer Stunde) bzw. nach 24 Stunden (Messwert Q₂₄) vorzunehmen. Eine objektive Bewertung der erzielten Pressflächen setzt einen möglichst einheitlichen Pressdruck voraus. Da die Kompressorien herstellermäßig nicht standardisiert sind und zudem der Abnutzung unterliegen, ist der Pressdruck der Geräte vor Gebrauch anhand einer Referenzpressfläche zu überprüfen.

5.4.1

Erstellung der Referenzpressfläche

Zur Erstellung der Referenzpressfläche wird die Silikonscheibe in möglichst mehreren als Vorlage dienenden, neuwertigen Kompressorien gepresst und die gepresste Fläche (arithmetisches Mittel der Einzelmesswerte) mit einem Filzstift auf die Auswerteschablone übertragen.

5.4.2

Überprüfung des „Braunschweiger Gerätes“

Vor jeder Verwendung des „Braunschweiger Gerätes“ ist der erforderliche Pressdruck zu überprüfen und ggf. zu regulieren. Dazu wird die Silikonscheibe auf die Mitte der unteren Plexiglasscheibe gelegt und nach Auflegen der oberen Scheibe gepresst. Die Pressfläche muss mit der Referenzfläche der Kontrollschablone übereinstimmen. Abweichungen sind durch Drehen, Wenden oder Austauschen der Plexiglasscheiben auszugleichen. Ist eine Korrektur nicht möglich, ist das Gerät zu ersetzen.

5.4.3

Durchführung der Pressung

Auf die untere Plexiglasscheibe des Gerätes wird Filterpapier aufgelegt. Mit Schere und Pinzette wird ein etwa erbsengroßes Stück Muskulatur von ca. 0,3 g aus dem jeweiligen Probenmaterial herausgeschnitten und auf die Mitte des Filterpapiers gelegt. Nach Auflegen der oberen Plexiglasfläche wird der Druckhebelmechanismus betätigt. Der Pressdruck soll 5 Minuten einwirken. Nach Aufheben des Pressdruckes und Entfernen der unteren Plexiglasscheibe wird der Umriss der Fleischfläche - bei undeutlicher Markierung auch der Umriss der Gesamtfläche - mit einem Stift im Gegenlicht markiert. Die Filterpapierscheibe wird von der oberen Plexiglasscheibe abgezogen und nach Entfernung des Fleischfilms und Beschriftung zum Abtrocknen plan auf die Unterlage gelegt. Sie kann nach der Auswertung zur Dokumentation aufbewahrt werden.

5.5

Auswertung

5.5.1

Verfahren

Zur Auswertung sind Pressproben geeignet, die annähernd runde Umrissbilder erkennen lassen. Die Gesamtpressfläche „F“, bestimmt durch den äußeren Rand der Feuchtigkeitszone, und die zentrale Fläche der Fleischzone „f“ werden den passenden nummerierten Kreisen der Auswerteschablone durch Verschieben der Schablone über der abgetrockneten Filterpapierscheibe zugeordnet. Über- und unterragende Randverläufe werden durch Abschätzung ausgeglichen. Bei nicht klar zuzuordnenden Ringwerten können auch Zwischenstufen als Ergebnis gewertet werden. Der Quotient „Q“ aus Fleischfläche „f“ und Gesamtfläche „F“ wird anhand der entsprechenden Schablonennummern aus der Auswerteschablone nach Nummer 5.6.1 abgelesen. Er wird berechnet nach der Formel

Q =	f
	F

5.5.2

Erläuterungen und Hinweise

5.5.2.1

Richtwerte

Niedrige Quotientenwerte „Q“, die auf einer großen auspressbaren Flüssigkeitsmenge beruhen, zeigen eine geringe Wasserbindung des Fleisches an. Umgekehrt lassen hohe Quotientenwerte auf eine Reduzierung der auspressbaren Flüssigkeitsmenge und infolgedessen auf eine hohe Wasserbindung schließen. Die sich aus den geschätzten sichtbaren Flächenanteilen ergebenden Quotienten können nach Nummer 5.6.2 ermittelt werden; Richtwerte für eine abweichende Wasserbindung sind unter Nummer 5.6.3 aufgeführt.

5.5.2.2

Beurteilung des Ausblutungsgrades

Eine starke Rotfärbung der Flüssigkeitsringzone ist als Hinweis auf eine schlechte Ausblutung zu werten.

5.6

Muster der Auswerteschablone nach Nummer 5.2.6, Umrechnungstabelle nach Nummer 5.5.1 sowie Tabellen zur Richtwertermittlung nach Nummer 5.5.2.1

5.6.1

Auswerteschablone zur Bestimmung der Flüssigkeits- und Fleischflächenränder

5.6.2

Tabelle zur Flächenberechnung nach der Auswerteschablone

Schablonen Nummer	Radius mm	Durchmesser mm	Fläche cm2
1	10	20	3,14
2	11	22	3,80
3	12	24	4,52
4	13	26	5,30
5	14	28	6,16
6	15	30	7,06
7	16	32	8,03
8	17	34	9,07
9	18	36	10,17
10	19	38	11,33
11	20	40	12,56
12	21	42	13,85
13	22	44	15,21
14	23	46	16,62
15	24	48	18,10

5.6.3

Tabelle zur Ermittlung der aus den sichtbaren Flächenanteilen gebildeten Quotienten („f“ = zentrale Fläche der Fleischzone, „F“ = Gesamtpressfläche)

f F	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
1	1
2	0,83	1
3	0,70	0,84	1
4	0,59	0,72	0,84	1
5	0,51	0,62	0,73	0,86	1
6	0,44	0,54	0,64	0,75	0,87	1
7	0,39	0,46	0,56	0,66	0,77	0,87	1
8	0,35	0,42	0,50	0,58	0,68	0,78	0,89	1
9	0,31	0,37	0,44	0,52	0,60	0,69	0,79	0,89	1
10	0,28	0,34	0,40	0,47	0,54	0,62	0,71	0,80	0,89	1
11	0,25	0,30	0,36	0,42	0,49	0,56	0,64	0,72	0,81	0,90	1
12	0,23	0,27	0,33	0,38	0,44	0,51	0,58	0,65	0,73	0,82	0,91	1
13	0,21	0,25	0,30	0,35	0,40	0,46	0,53	0,60	0,67	0,74	0,83	0,91	1
14	0,19	0,22	0,27	0,32	0,37	0,42	0,48	0,55	0,61	0,68	0,76	0,83	0,92	1
15	0,17	0,21	0,25	0,29	0,34	0,39	0,44	0,50	0,56	0,63	0,69	0,77	0,84	0,92	1

5.6.4

Richtwerte für die Wasserbindung

auspressbares Gewebewasser	Schwein	Rind
hochgradig erhöht	Q1 ≤ 0,4 Q24 ≤ 0,35	- *) - *) oben
mäßig erhöht	Q1 ≤ 0,5 Q24 ≤ 0,4	Q1	≤ 0,5
		Q24	≤ 0,35 AD
					0,4 LD
mäßig reduziert	Q1 ≥ 0,64 Q24 ≥ 0,64	Q1	≥ 0,6
		Q24	≥ 0,55 AD
				0,6 LD
hochgradig reduziert	Q1 ≥ 0,72 Q24 ≥ 0,72	- *) - *)

6.

Feststellung von Geruchs- und Geschmacksabweichungen im Sinne der Verordnung (EG) Nr. 854/2004

Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methoden beschreiben Verfahren zur sensorischen Feststellung von Geruchs- oder Geschmacksabweichungen bei Fleisch von geschlachteten Tieren und erlegtem Haarwild nach Anhang I Abschnitt II Kapitel V Nummer 1 Buchstabe p. Das Probenmaterial darf nicht verunreinigt sein (insbesondere nicht durch Darminhalt oder Urin) und ist sorgfältig in einem verschlossenen, sauberen und geruchsneutralen Behältnis zu transportieren. Die Untersuchung erfolgt bei frischem Fleisch (Schlachtkörper) frühestens 24 Stunden nach dem Schlachten bzw. Erlegen.

Bei Fleisch, das hochgradige Geruchsabweichungen aufweist, kann auf die Geschmacksprüfung verzichtet werden. Die Geschmacksprüfung hat zu unterbleiben, wenn der Verdacht besteht, dass das Fleisch Krankheitserreger oder Rückstände von Substanzen mit pharmakologischer Wirkung oder von anderen Stoffen enthält, die geeignet sind, das Fleisch für die Gesundheit des Menschen gefährlich zu machen. Die sensorische Beurteilung sollte von mindestens zwei erfahrenen Prüfern durchgeführt werden.

6.1

Orientierende Feststellung mit Hilfe des Mikrowellen-Diathermie-Verfahrens

6.1.1

Kurzbeschreibung

Insbesondere bei Anfall größerer Probenzahlen geeignete Schnellmethode, bei der die in Folienbeutel verpackten Fleischproben in haushaltsüblichen Mikrowellen-Geräten erhitzt werden.

6.1.2

Geräte

6.1.2.1

Mikrowellengerät (Haushaltsausführung; Drehteller nicht erforderlich);

6.1.2.2

Waage;

6.1.2.3

sterilisationsfeste geruchs- und geschmacksneutrale Folienbeutel oder haushaltsübliche Bratfolie oder Gläser, die mit einem passgenauen, lose aufgelegten Deckel verschlossen sind.

6.1.3

Durchführung

Eine vorzugsweise aus dem Kopfbereich entnommene ca. 50 g schwere Fleischprobe (möglichst mit Fettgewebs- und Speicheldrüsenanteilen) wird in mehrere Würfel von etwa 1 cm Kantenlänge zerlegt und im endseitig verschlossenen Folienbeutel bzw. im verschlossenen „Bratschlauch“ möglichst schnell bis zur Dampfbildung erhitzt. Die Muskulatur sollte dabei deutlich vergraut sein; Krustenbildung ist zu vermeiden.

Sicherheitshinweise des Folienherstellers sind zu beachten, da durch die Dampfbildung Druckentwicklung möglich ist; ggf. sind die Folienbeutel vor dem Erhitzen zu perforieren.

6.1.4

Auswertung

Unmittelbar nach Abschluss des Erhitzungsvorgangs wird das Probenbehältnis geöffnet und die Geruchsprüfung ‑ auch des vorsichtig zugefächelten austretenden Dampfes ‑ vorgenommen. Nach einigen Minuten Abkühlphase wird die Geruchsprüfung wiederholt und ggf. durch eine Geschmacksprüfung ergänzt. Auffällige Befunde bedürfen zur abschließenden Bewertung einer Bestätigung mit Hilfe eines der Verfahren nach Nummer 6.2 oder 6.3.

6.2

Feststellung mit Hilfe von Kochproben

6.2.1

Kurzbeschreibung

Als Kochproben werden Verfahren bezeichnet, bei denen Untersuchungsmaterial in einem Wasseraufguss (Trinkwasser) erhitzt und der entstehende Dampf sowie der Extrakt und ggf. das Fleisch anschließend sensorisch beurteilt werden.

6.2.1.1

Kaltansatz

Grob gewürfeltes Muskelfleisch mit Bindegewebe (beim Verdacht auf Geschlechtsgeruch und -geschmack beim männlichen Schwein auch gesondert Speicheldrüsen- und Fettgewebe) werden in kaltes Trinkwasser gegeben und darin zum Sieden erhitzt. Der Geruch des beim Kochen sich entwickelnden Dampfes sowie Geruch und Geschmack des Extraktes (Kochbrühe) werden in heißem und erkaltetem Zustand geprüft.

6.2.1.2

Heißansatz

Ein von Binde- und Fettgewebe grob befreites Stück Muskelfleisch wird in siedendes Trinkwasser gegeben. Die durch sofortige Oberflächenkoagulation im Innern des Fleisches weitgehend eingeschlossenen Geruchs- und Geschmackskomponenten werden nach Anschnitt in der Tiefe des Fleisches in heißem und erkaltetem Zustand geprüft.

6.2.2

Geräte und Hilfsmittel

6.2.2.1

Wärmequelle;

6.2.2.2

Weithals-Erlenmeyer-Kolben, Nennvolumen 250 ml mit geruchsneutraler Abdeckung (zum Beispiel Aluminiumfolie);

6.2.2.3

Kochtopf oder feuerfestes Glasgefäß, Nennvolumen 2 000 ml mit Deckel;

6.2.2.4

Waage;

6.2.2.5

Messzylinder, Nennvolumen 500 ml mit 10 ml-Graduierung;

6.2.2.6

Messzylinder, Nennvolumen 100 ml mit 10 ml-Graduierung;

6.2.2.7

Thermometer.

6.2.3

Durchführung

6.2.3.1

Kaltansatz

Aus der Tiefe verschiedener Körperteile, ggf. aus besonders verdächtigen Bereichen (zum Beispiel Filet- und Bauchmuskulatur bei verspätet ausgeweidetem Haarwild) werden mehrere Fleischstücke mit Bindegewebsanteilen mit einem Gesamtgewicht von etwa 60 g entnommen, in Würfel mit einer Kantenlänge von etwa 2 cm aufgeschnitten, in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit 90 ml kaltem Wasser bedeckt. Nach schonender Erhitzung bis auf Siedetemperatur wird bei der auf etwa +75 °C abgekühlten Probe der aus dem Kolben aufsteigende Geruch geprüft. Ebenso werden Geruch und Geschmack der Kochbrühe geprüft. Diese Prüfung wird bei der auf etwa +25 °C abgekühlten Probe wiederholt.

6.2.3.2

Heißansatz

Soweit die Tiergröße es zulässt, wird ein würfelförmiges Muskelfleischstück mit einer Kantenlänge von etwa 10 cm aus dem Nackenbereich entnommen. Bei kleineren Tieren ist ein anderes zusammenhängendes Fleischstück zu entnehmen. Das Fleischstück wird in ein mit etwa 1 l siedenden Wassers gefülltes Gefäß gegeben. Der Fleischwürfel muss vollständig in das Wasser eingetaucht sein. Nach erneutem Aufkochen ist der Inhalt für weitere 5 Minuten bei Siedetemperatur zu halten. Die Probe ist danach aus der Flüssigkeit zu nehmen und zu zerteilen. Unmittelbar nach dem Aufschneiden werden Geruch und Geschmack im Innern des Fleischstückes geprüft.

6.2.4

Auswertung

6.2.4.1

Bewertung und Angabe der Ergebnisse

„negativ“ („ – “):	Fleisch, das weder in kaltem noch in erhitztem Zustand Geruchs- oder Geschmacksabweichungen aufweist;
„mäßig abweichend“ („ + “):	Fleisch, das in kaltem Zustand keine, in erhitztem Zustand geringe bis mittelgradige Geruchs- und/oder Geschmacksabweichungen aufweist;
„hochgradig abweichend“ („ ++ “):	Fleisch, das in kaltem Zustand geringe bis mittelgradige und/oder in erhitztem Zustand hochgradige Geruchs- und/oder Geschmacksabweichungen aufweist.

Eine Abweichung liegt auch dann vor, wenn nur Geruchs- oder nur Geschmacksabweichungen festgestellt werden. Bei mäßigen Abweichungen sollten vor einer abschließenden Beurteilung der sensorischen Qualität des Fleisches weitere Untersuchungen durchgeführt werden (zum Beispiel Ausschmelzprobe), sofern die bis dahin erhobenen Befunde nicht bereits seine Genussuntauglichkeit ergeben haben. Bei typischen Geruchs- oder Geschmacksabweichungen ist ein entsprechender Hinweis (zum Beispiel „Geschlechtsgeruch“) zu geben.

6.2.4.2

Auswertung bei Beurteilung durch mehrere Prüfer

Wird die sensorische Prüfung von mehreren Personen ausgeführt, so ist unter Zugrundelegung der Einzelergebnisse ein Gesamturteil abzugeben. Stellen mindestens zwei Personen eine Geruchs- oder Geschmacksabweichung fest, so muss die Probe als „abweichend“ beurteilt werden. Stellen mindestens zwei Personen eine hochgradige Abweichung fest, so ist die Probe als „hochgradig abweichend“ zu beurteilen. Stellt nur eine Person eine mäßige Abweichung (bei gleichzeitiger Beurteilung als „negativ“ durch die anderen Personen) oder eine hochgradige Abweichung fest, so ist die Prüfung zu wiederholen und das zweite Prüfungsergebnis heranzuziehen. Ergibt sich bei der Wiederholung das gleiche Ergebnis, so ist das Prüfungsergebnis dieser einen Person maßgebend für das Gesamturteil.

6.2.5

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung des Tieres;

-

Art und Datum der Schlachtung oder des Erlegens;

-

Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von dieser Methode abgewichen wurde.

6.3

Feststellung bei Fettgewebe mit Hilfe der Ausschmelzprobe

6.3.1

Kurzbeschreibung

Feingewürfeltes Fettgewebe wird über einer Hitzequelle vorsichtig ausgeschmolzen, ohne dass das Bindegewebe dabei gebräunt wird. Die entstehenden Dämpfe werden geruchlich geprüft.

6.3.2

Chemikalien

6.3.2.1

Kontrollsubstanzen, zum Beispiel Ebergeruchsstoff⁹⁾.

6.3.3

Geräte und Hilfsmittel

6.3.3.1

Feuerfestes Glasgefäß (Durchmesser ca. 15 cm) mit planem Boden und Deckel oder anderes geeignetes Gefäß;

6.3.3.2

Einweg-Aluminiumkappen oder Aluminiumfolie;

6.3.3.3

Wärmequelle;

6.3.3.4

Schutzbrille;

6.3.3.5

Filterpapierblättchen¹⁰⁾ (Durchmesser ca. 8 cm) zur Beschickung mit Kontrollsubstanz nach Nummer 6.3.1.1 bei vorgegebener Duftnote (zum Beispiel Geschlechtsgeruch);

6.3.3.6

Glaspetrischalen oder andere geeignete Gefäße zur Aufnahme der „Duftblättchen“;

6.3.3.7

Reagenzgläser und Pipetten.

6.3.4

Durchführung

Etwa 150 g Fettgewebe (bei Schweinen Rückenfett) ohne Muskulatur und weitgehend frei von Bindegewebe werden entnommen. Je 20 g Fettgewebe werden in Würfel von etwa 5 mm Kantenlänge geschnitten und gleichmäßig auf dem Boden der Prüfgefäße verteilt. Das Ausschmelzen erfolgt schonend bis zum Austritt des flüssigen Fettes, ohne dass das verbleibende Bindegewebe sich hierbei bräunen darf. Unter Zuhilfenahme einer Schutzbrille (Spritzgefahr) wird der Geruch der entweichenden Dämpfe aus kurzer Entfernung geprüft. Geruchsabweichungen werden nach ihrer Eigenart beschrieben. Die Intensität der Abweichungen wird wie folgt angegeben:

-

„negativ“ („ - “);

-

„mäßig abweichend“ („ + “);

-

„hochgradig abweichend“ („ ++ “).

Bei Verdacht auf spezifische Geruchsabweichungen können auch entsprechende Kontrollsubstanzen nach Nummer 6.3.1.1 als Positivkontrolle mitgeführt werden. Bei mäßigen Abweichungen sollten vor einer abschließenden Beurteilung der Eignung des Fleisches weitere Untersuchungen nach Nummer 6.2 durchgeführt werden, sofern die bis dahin erhobenen Befunde nicht bereits seine Untauglichkeit zum Genuss für Menschen ergeben haben. Bei typischen Geruchs- oder Geschmacksabweichungen ist ein entsprechender Hinweis (zum Beispiel „Geschlechtsgeruch“) zu geben.

6.3.5

Auswertung bei Beurteilung durch mehrere Prüfer

Wird die sensorische Prüfung von mehreren Personen ausgeführt, so ist unter Zugrundelegung der Einzelergebnisse ein Gesamturteil abzugeben. Stellen mindestens zwei Personen eine Geruchsabweichung fest, so muss die Probe als „abweichend“ beurteilt werden. Stellen mindestens zwei Personen eine hochgradige Abweichung fest, so ist die Probe als „hochgradig abweichend“ zu beurteilen. Stellt nur eine Person eine mäßige Abweichung (bei gleichzeitiger Beurteilung als „negativ“ durch die anderen Personen) oder eine hochgradige Abweichung fest, so ist die Prüfung zu wiederholen und das zweite Prüfungsergebnis heranzuziehen. Ergibt sich bei der Wiederholung das gleiche Ergebnis, so ist das Prüfungsergebnis dieser einen Person maßgebend für das Gesamturteil.

6.3.6

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung des Tieres;

-

Art und Datum der Schlachtung bzw. des Erlegens;

-

Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von dieser Methode abgewichen wurde.

6.4

Feststellung bei Fleischerzeugnissen

Im Rahmen der sensorischen Untersuchung von Fleischerzeugnissen ist auf Geruchs- und ggf. Geschmacksabweichungen zu prüfen. Soweit erforderlich sind hierzu frische Schnittflächen anzulegen und diese sensorisch zu untersuchen. Fettproben oder fettreiche Fleischproben sind in jedem Fall zu erwärmen.

6.4.1

Fettarme oder fettfreie Fleischproben

Sofern die sensorische Untersuchung der Schnittflächen keine ausreichende Beurteilung ermöglicht, ist Material aus dem Innern zu entnehmen, das in Anlehnung an die Verfahren nach Nummer 6.2 erhitzt wird. Die zu verwendende Trinkwassermenge sollte ggf. reduziert werden.

6.4.2

Fettproben oder fettreiche Fleischproben

6.4.2.1

Geräte und Hilfsmittel

6.4.2.1.1

Aluminiumbecher oder -schale (etwa 5-7 cm Durchmesser, etwa 6 cm hoch mit 140-180 ml Fassungsvermögen);

6.4.2.1.2

Wärmequelle (zum Beispiel Bunsenbrenner).

6.4.2.2

Durchführung

Der Aluminiumbecher wird mit etwa 20 g Fett oder fettreichem Fleisch beschickt und bis zum Auftreten des ersten bläulichen Rauches (+160 bis +170 °C) langsam über freier Flamme erhitzt. Während des Erhitzens ist das Fett von Zeit zu Zeit unter gleichzeitigem Umschütteln geruchlich zu prüfen. Geruchsabweichungen, die erst anlässlich der Rauchbildung auftreten, werden bei der Erhitzungsprobe nicht bewertet.

6.4.3

Auswertung

Die Auswertung erfolgt in Anlehnung an die unter Nummer 6.2 und 6.3 genannten Verfahren.

7.

Methode zur Differenzierung der Gelbfärbung des Fleisches

7.1

Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Differenzierung der Gelbfärbung des Fleisches von Schlachttieren und erlegtem Haarwild. Unter Gelbfärbung wird sowohl die durch Gallenfarbstoffe verursachte (ikterische) als auch die durch Futterinhaltsstoffe (Carotinoide) bedingte (lipochromatöse) gelbliche Verfärbung des Fleisches, insbesondere des Fett- und Bindegewebes, verstanden.

7.2

Kurzbeschreibung

Zerkleinertes Fleisch (Fett- und Bindegewebe) wird zum einen mit Äthanol, zum anderen mit Diäthyläther extrahiert. Im Fleisch vorhandene Gallenfarbstoffe färben den Äthanol-, Carotinoide den Diäthyläther-Extrakt gelb und lassen sich so voneinander unterscheiden.

7.3

Chemikalien

7.3.1

Äthanol 70 %¹¹⁾;

7.3.2

Diäthyläther p.a.¹²⁾.

7.4

Geräte und Hilfsmittel

7.4.1

Waage;

7.4.2

Reagenzgläser und Pipetten.

7.5

Durchführung

Aus dem zu untersuchenden Schlachtkörper oder Fleischstück werden blutfreie Fett- und Bindegewebsstücke in einer Menge von insgesamt 50 g entnommen. Zweimal 5 g Fett- und Bindegewebe werden zerkleinert und in Reagenzgläser verbracht. Anschließend wird eines der Röhrchen mit 8 ml Äthanol, das andere mit 8 ml Diäthyläther beschickt. Beide Röhrchen werden ca. 10 Minuten kräftig geschüttelt und dann stehengelassen. Die Ablesung erfolgt nach 2 Stunden.

7.6

Auswertung und Angabe der Ergebnisse

Eine Gelbfärbung des Diäthyläther-Extraktes zeigt Carotinoide an, eine Gelbfärbung des Äthanol-Extraktes weist auf das Vorhandensein von Gallenfarbstoffen hin.

Das Ergebnis wird angegeben als

„negativ“:	Äthanol- und Diäthyläther-Extrakt farblos;
„lipochromatöse Verfärbung“:	Äthanol-Extrakt farblos, Diäthyläther-Extrakt gelb;
„ikterische Verfärbung“:	Äthanol-Extrakt gelb, Diäthyläther-Extrakt farblos;
„ikterisch-lipochromatöse Verfärbung“:	Äthanol- und Diäthyläther-Extrakt gelb.

7.7

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf diese Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung des Tieres;

-

Art und Datum der Schlachtung oder des Erlegens;

-

Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von dieser Methode abgewichen wurde.

8.

Nachweis der Behandlung von frischem Fleisch

8.1

Kurzbeschreibung

Die Feststellung, ob es sich um frisches oder erhitztes Fleisch handelt, ist durch Besichtigung der innersten Schichten des Fleisches vorzunehmen. Bei erhitztem Fleisch besitzt der an frischen Schnittflächen austretende Saft keine rötliche Farbe mehr. Darüber hinaus kann mit einfachen chemischen Verfahren Erhitzung (Nummer 8.2), Pökelung (Nummer 8.3) oder der Zusatz einiger natürlicher Farbstoffe (Nummer 8.4) nachgewiesen werden.

8.2

Nachweis der Erhitzung

8.2.1

Geräte und Hilfsmittel

8.2.1.1

Wasserbad (+65 °C ±1 °C);

8.2.1.2

Thermometer;

8.2.1.3

Trichter und Faltenfilter (Schleicher #amp;# Schüll, Nr. 1574);

8.2.1.4

Dünnwandige Fiolax-Reagenzgläser (70 x 8 mm).

8.2.2

Durchführung

Von der Probe ist etwa 1 g zu entnehmen, soweit wie möglich zu zerkleinern und mit 5 ml destilliertem Wasser nach mehrmaligem Umschütteln 5 Minuten lang zu extrahieren. Von dem nach zweimaligen Filtrieren durch Faltenfilter gewonnenen, nahezu klaren Extrakt sind 2 ml in Fiolax-Reagenzgläsern in einem Wasserbad so lange zu erhitzen, bis in einem Kontrollröhrchen die Temperatur von +65 °C 15 Minuten lang eingewirkt hat. Danach sind die Röhrchen auf Zimmertemperatur abzukühlen.

8.2.3

Auswertung

Die Beurteilung ist nach 15 Minuten vorzunehmen. Bei flockiger Ausfällung ist das Fleisch als nicht durch Erhitzen zubereitet anzusehen. Später eintretende Ausfällungen bleiben unberücksichtigt.

8.3

Nachweis des Pökelns (Kochsalzbestimmung)

8.3.1

Chemikalien

8.3.1.1

Carrez-Lösungen I und II;

8.3.1.2

0,1 N Silbernitratlösung nach Mohr;

8.3.1.3

ausgeglühter Seesand.

8.3.2

Geräte und Hilfsmittel

8.3.2.1

Homogenisator;

8.3.2.2

200 ml Weithals-Messkolben;

8.3.2.3

Wasserbad (ca. +100 °C);

8.3.2.4

Trichter und Faltenfilter;

8.3.2.5

Trockenschrank (+105 °C ±1 °C);

8.3.2.6

flache Aluminiumschale und Glasstab.

8.3.3

Durchführung

10 g der homogenisierten Probe sind in den 200 ml Messkolben einzuwiegen, mit etwa 100 ml heißem Wasser zu übergießen und unter öfterem Umschütteln 15 Minuten im Wasserbad zu kochen. Nach dem Erkalten sind je 10 ml Carrez-Lösung I und II zuzugeben und die Lösung bis zum Messstrich mit Wasser aufzufüllen. Nach dem Umschütteln ist die Lösung zu filtrieren. Vom klaren Filtrat sind 20 ml mit 0,1 N Silbernitratlösung nach Mohr zu titrieren.

Sofern ein Kochsalzgehalt von weniger als 6 vom Hundert, jedoch von mindestens 4 vom Hundert festgestellt wird, ist der Wassergehalt nach folgendem Verfahren zu bestimmen:

10 g der homogenisierten Probe sind in einer mit ausgeglühtem Seesand und mit einem Glasstab versehenen flachen Schale einzuwiegen. Nach sorgfältiger Verreibung der Probe mit dem Seesand wird diese Mischung 3 Stunden im Trockenschrank bei +105 °C getrocknet. Nach Feststellung des Gewichtes ist so lange jeweils eine halbe Stunde weiter zu trocknen, bis das Gewicht entweder konstant bleibt oder wieder zu steigen beginnt. Als Endgewicht gilt die vor dem Wiederansteigen bestimmte Wägung.

8.3.4

Auswertung

Auswertung und Erstellung des Untersuchungsberichtes erfolgen in Anlehnung an die Methode L 06.00-5 „Untersuchung von Lebensmitteln, Bestimmung des Kochsalzgehaltes in Fleisch und Fleischerzeugnissen“ der amtlichen Sammlung nach § 35 LMBG.

8.4

Nachweis natürlicher Farbstoffe

8.4.1

Chemikalien

8.4.1.1

Aluminiumoxid (Merck);

8.4.1.2

Schwefelsäure, 40 %ig;

8.4.1.3

Petroläther;

8.4.1.4

Chloroform;

8.4.1.5

Reagenz nach Carr-Price;

8.4.1.6

Äthanol.

8.4.2

Geräte und Hilfsmittel

8.4.2.1

Stativ mit Hahnbürette;

8.4.2.2

Glasplatte (ca. 20 x 20 cm).

8.4.3

Durchführung und Auswertung

Die in Verdachtsfällen vorzunehmende chemische Untersuchung auf das Vorhandensein zugesetzter natürlicher Farbstoffe ist als Vorprobe zu betrachten. Zur exakten Bestimmung sind die Farbstoffe nach Extraktion mit Äthanol ‑ zum Beispiel mit UV-spektroskopischen Methoden ‑ weiter zu untersuchen.

Auf eine Glasplatte ist eine Schicht Aluminiumoxid von etwa 2 mm Dicke und 12 cm Durchmesser gleichmäßig aufzutragen. Im Mittelpunkt ist durch Auftropfen von 40 %iger Schwefelsäure ein etwa eurocentstückgroßer Fleck zu erzeugen, in dessen Mitte einige Tropfen einer Petrolätherlösung des zu untersuchenden Fettes aufgebracht werden. Danach ist aus einer Hahnbürette Petroläther aus einer Entfernung von etwa 0,3 bis 0,5 cm so lange in das Schwefelsäurezentrum zu tropfen, bis die Petrolätherzone den Rand der Aluminiumoxidschicht erreicht hat.

Tomatenfarbstoff gibt bereits beim Betropfen mit Petroläther einen roten Ring, der in 2 bis 3 cm Entfernung vom Schwefelsäurezentrum auftritt.

Paprika zeigt sich als gelbroter Ring, der sich an die Schwefelsäuregrenze anschließt und der nach anschließendem Aufgeben einiger Tropfen Chloroform 2 bis 3 cm radial nach außen wandert. Nach Verdunsten des Lösungsmittels schlägt die Farbe in gelborange um.

Carotin wandert mit der Petrolätherentwicklung nach außen und bildet eine charakteristisch gezackte Linie; mit Chloroform entwickelt setzt es sich am Rande der Aluminiumoxidschicht ab.

Annatto wandert nicht und ist auch mit keinem Lösungsmittel auszuwaschen. Mit dem Reagenz nach Carr-Price färbt sich Annatto blaugrün.

8.5

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf die jeweils angewandte Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;

-

Art und Datum der Probenahme;

-

Eingangs- und Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von den hier beschrieben Methoden abgewichen wurde.

9.

Untersuchung von ausgelassenem Fett

9.1

Kurzbeschreibung

Bei ausgelassenen Fetten (Schmalz) können durch physikalische und chemische Verfahren der Wassergehalt und flüchtige Stoffe (Nummer 9.2), der Gehalt an freien Fettsäuren (Nummer 9.3) und die Peroxidzahl (Nummer 9.4) bestimmt sowie die Raffination (Nummer 9.5) nachgewiesen werden.

9.2

Untersuchung auf Wassergehalt und andere flüchtige Stoffe

Voraussetzung für die Anwendbarkeit dieser Arbeitsweise ist die Abwesenheit anderer unlöslicher Stoffe (Gewebeteile usw.).

9.2.1

Geräte und Hilfsmittel

9.2.1.1

starkwandige Reagenzgläser (Fassungsvermögen mind. 18 ml);

9.2.1.2

Gummistopfen mit Bohrung für Thermometer;

9.2.1.3

Thermometer mit einer Ablesegenauigkeit von mindestens +0,1 °C;

9.2.1.4

Bunsenbrenner;

9.2.1.5

Waage;

9.2.1.6

Trockenschrank (+105 °C ±1 °C);

9.2.1.7

flache Aluminiumschale und Glasstab;

9.2.1.8

gereinigter, ausgeglühter Seesand.

9.2.2

Durchführung und Auswertung

10 g der gut durchmischten Fettprobe werden in ein starkwandiges Reagenzglas verbracht, das mit einem Gummistopfen verschlossen wird, durch dessen Bohrung ein Thermometer so weit eingeführt ist, dass die Quecksilberkugel sich in der Mitte des Untersuchungsgutes befindet. Durch vorsichtiges Erwärmen über freier Flamme wird das Fett auf +50 bis +52 °C erhitzt und, wenn es bei dieser Temperatur klar geschmolzen ist, an der Luft so lange geschüttelt, bis die Temperatur auf +40 °C gefallen ist. Tritt dabei keine Trübung ein, so beträgt der Wassergehalt weniger als 0,15 %. Falls das Fett bei +50 bis +52 °C nicht vollständig geschmolzen ist, wird zunächst auf +75 °C und danach erforderlichenfalls auf +95 °C erhitzt. Ist die Fettprobe bei +95 °C nicht zu einer klaren Flüssigkeit geschmolzen, enthält sie mehr als 0,45 % Wasser. Der Versuch sollte zwei- bis dreimal durchgeführt werden. Der ungefähre Wassergehalt der Fettprobe kann aus der folgenden Tabelle ermittelt werden.

Nachweisbarer Wassergehalt in Abhängigkeit von der Trübungstemperatur

Bei Verdacht auf möglicherweise vorhandene andere flüchtige Stoffe sind 5 bis 10 g der zuvor sorgfältig durchmischten Fettprobe in eine flache Schale zusammen mit Seesand einzuwiegen und möglichst gleichmäßig zu verteilen. Die Schale ist danach in einem Trockenschrank auf +105 °C zu erwärmen. Nach 30 Minuten ist das Gewicht erstmals festzustellen und danach alle 10 Minuten, bis keine Gewichtsabnahme mehr zu bemerken ist.

9.3

Untersuchung auf den Gehalt an freien Fettsäuren

9.3.1

Chemikalien

9.3.1.1

0,1 N alkoholische Kalilauge;

9.3.1.2

0,5 N alkoholische Kalilauge;

9.3.1.3

Lösungsmittelgemisch aus je einem Teil Äthanol (95 %) und Äthyläther oder Gemisch aus einem Teil Äthanol (96 %) und zwei Teilen Reinbenzol;

9.3.1.4

alkoholische Phenolphthaleinlösung, 1 %ig.

9.3.2

Geräte

9.3.2.1

Pipetten;

9.3.2.2

200 ml Weithals-Erlenmeyer-Kolben.

9.3.3

Durchführung und Auswertung

5 bis 10 g (auf ±1 % genau eingewogen) der Fettprobe sind in etwa 100 bis 150 ml eines neutralen Lösungsmittelgemisches nach Nummer 9.3.1.3 zu lösen. Das zum Lösen des Schmalzes zu verwendende Lösungsmittelgemisch ist vor Gebrauch nach Zusatz einiger Tropfen der Phenolphthaleinlösung durch Titration mit 0,1 N alkoholischer Kalilauge auf eine ganz leichte Rotfärbung einzustellen. Nach Zusatz von einigen Tropfen der Phenolphthaleinlösung ist schnell mit 0,5 N alkoholischer Kalilauge ‑ im Falle eines geringeren Gehaltes an freien Fettsäuren mit 0,1 N alkoholischer Kalilauge ‑ bis zum Farbumschlag des Indikators zu titrieren. Der Endpunkt der Titration ist erreicht, wenn die Rotfärbung der Lösung 3 bis 5 Sekunden bestehen bleibt.

Berechnung:	Freie Fettsäure =	A × 28,05	× 0,5027
		E

wobei „A“ die verbrauchten ml 0,5 N Kalilauge und „E“ die Einwaage der Fettprobe in Gramm bedeuten.

9.4

Bestimmung der Peroxidzahl

Die Peroxidzahl ist ein Maß für den Gehalt eines Fettes oder Öles an gebundenem Sauerstoff, insbesondere Hydroperoxiden, und dient neben anderen Kennzahlen zur Beurteilung des Oxidationsgrades. Die Durchführung dieser Untersuchung erfolgt nach der Methode L 13.00-6 „Untersuchung von Lebensmitteln, Bestimmung der Peroxidzahl in Fetten und Ölen (Verfahren nach Wheeler, Verfahren nach Sully)“ der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG.

9.5

Nachweis der Raffination

9.5.1

Vorbemerkung

Als Vorprobe auf Raffination ist auf die Eigenfluoreszenz und auf kreidig-weißliche Farbtönungen bei der Neutralrot-Fluoreszenzlösung zu achten.

Sowohl raffiniertes und gehärtetes Schmalz als auch raffiniertes Abfallschmalz fällt durch die ausgesprochen bläulichweiße Eigenfluoreszenz auf, die sich unter der Ultraviolett-Analysen-Quarzlampe auch im Grundton der Neutralrot-Fettprobe auswirkt.

Weist die Fluoreszenzfarbe bei der Neutralrot-Fettprobe einen stark weißen (kreidigen), zuweilen auch bläulich-weißen Grundton auf, so besteht der Verdacht, dass gehärtetes Schmalz oder raffinierte Fette vorliegen.

9.5.2

Chemikalien

9.5.2.1

Neutralrot-Stammlösung;

9.5.2.2

Frisch hergestellte Neutralrotlösung (1 : 10 000 mit Leitungswasser);

9.5.2.3

Ammoniak;

9.5.2.4

Hexan, optisch rein.

Als Lösungsmittel ist optisch reines Hexan zu verwenden. Dieses ist durch Fraktionieren zu reinigen, wobei von 1 l Hexan 200 ml Vorlauf und 200 ml Rücklauf zu verwerfen sind. Die mittlere Fraktion ist durch eine mit Silicagel dicht gepackte Säule von 120 cm Länge und 4,5 cm Durchmesser zu schicken. Der Durchlauf ist in Partien von 50 bis 100 ml auf seine optische Reinheit durch Bestimmung der Extinktion im Spektralphotometer bei den Wellenlängen 220, 230 und 255 nm gegen reines Wasser zu prüfen. Dabei darf ein Extinktionswert von 0,1 nicht überschritten werden.

9.5.3

Geräte

9.5.3.1

Porzellantüpfelplatte und Spatel;

9.5.3.2

25 ml Messkolben;

9.5.3.3

Reagenzgläser;

9.5.3.4

Wasserbad;

9.5.3.5

UV-Quarzlampe;

9.5.3.6

Spektralphotometer und Quarzküvetten.

9.5.4

Durchführung und Auswertung

Auf eine Porzellan-Tüpfelplatte werden 3 Schmalzproben (je 1 g) gegeben. Die erste Probe bleibt unverändert und wird glatt gestrichen. Die zweite und dritte Probe werden jeweils mit einigen Tropfen (0,3 ml) einer frisch hergestellten Neutralrot-Lösung mit einem Spatel kräftig verrieben und die überstehende Farbstofflösung nach etwa 3 Minuten abgegossen. Unter dem filtrierten UV-Licht einer Analysen-Quarzlampe wird auf blauviolette bis weiß-bläuliche Eigenfluoreszenz und besonders auf etwaige kreidig-weißliche Tönungen der beiden Neutralrot-Fluoreszenzproben geachtet. Falls die sehr pH-empfindliche Neutralrot-Reaktion infolge stark ausgeprägter orange-rosa-roter Färbungen den zu beobachtenden Grundton-Effekt stört, ist eine der beiden Proben mit wenig Ammoniak vorsichtig zu neutralisieren, um die Beurteilung hinsichtlich des Raffinationsverdachtes zu erleichtern. Ergibt sich bei der Vorprobe ein Verdacht, dann ist spektralphotometrisch wie folgt zu prüfen:

Die aus dem Innern des Untersuchungsmaterials zu entnehmende Probe ist in einem Reagenzglas vorsichtig im Wasserbad zu schmelzen. Danach sind 0,25 ±0,01 g des geschmolzenen Fettes in 25 ml Messkolben einzuwiegen, in optisch reinem Hexan zu lösen und mit optisch reinem Hexan bis zum Eichstrich des Messkolbens aufzufüllen. Diese Lösung ist im Spektralphotometer bei den Wellenlängen 264, 268 und 272 nm gegen optisch reines Hexan in einer 1 cm Quarzküvette zu messen und die Extinktion abzulesen.

Berechnung:	E =	1 %	=	E abgelesen
		1 cm		c × d

wobei „E“ die Einwaage in g multipliziert mit 4 und „d“ die Schichtdicke in cm bedeutet.

Daraus errechnen sich T-Wert und Q-Wert wie folgt:

T = E 248 -	E 241 - E 472	× 100
	2

Q =	T
	E 248

Grenzwerte sind	T-Wert: 1,0,
	Q-Wert: 6,0 wenn T-Wert 1,0.

Bei Q-Werten über 5,0 ist nach dem Anreicherungsverfahren zu prüfen.

9.6

Untersuchungsbericht

Im Untersuchungsbericht sind unter Hinweis auf die jeweils angewandte Methode mindestens anzugeben:

-

Art, Herkunft und Bezeichnung der Probe;

-

Art und Datum der Probenahme;

-

Eingangs- und Untersuchungsdatum;

-

Untersuchungsergebnis;

-

Begründung, falls von den hier beschriebenen Methoden abgewichen wurde.

10.

Prüfung luftdicht verschlossener Behältnisse

Bei luftdicht verschlossenen Behältnissen (zum Beispiel Dosen) sind diese auf Dichtigkeit und das Vorliegen von Korrosion zu prüfen. Dosen sind so zu öffnen, dass ein Deckelrand von 2 bis 3 cm verbleibt. Danach ist der Inhalt zu entfernen; die Dose ist unter Verwendung von oberflächenaktiven Spülmitteln innen und außen gründlich zu reinigen. Anschließend ist sie zur Hälfte mit Wasser zu füllen und mit einem Dichtigkeitsprüfer (zum Beispiel nach Hepp) zu verschließen. Durch Einführen von Luft (Luftpumpe) ist ein Innendruck von ca. 2 bar herbeizuführen. Zur Prüfung auf Dichtigkeit wird das Behältnis so in ein Gefäß mit Wasser gelegt, dass es vollkommen damit bedeckt ist; Blasenbildung zeigt Undichtigkeiten an.

11.

Analysenmethoden für die Untersuchungen auf bestimmte Stoffe und ihre Rückstände

11.1

Zweck und Anwendungsbereich

Diese Vorschriften über die Ermittlung von Rückständen und Stoffen sowie über Überwachungspläne gewährleisten eine einheitliche Durchführung der Kontrollmaßnahmen bei amtlichen Kontrollen und Untersuchungen sowie des nationalen Rückstandskontrollplans.

11.2

Rückstände von Stoffen mit pharmakologischer Wirkung und von Kontaminanten

11.2.1

Bei der Durchführung der Probenahme und der Behandlung der Proben zur Rückstandsuntersuchung nach Anhang I Kapitel II Teil D Nummer 2 Buchstabe b Ziffer ii und Teil F Nummer 1 Buchstabe c der Verordnung (EG) Nr. 854/2004 sind die Regelungen der Entscheidung 98/179/EG der Kommission vom 23. Februar 1998 mit Durchführungsvorschriften für die amtlichen Probenahmen zur Kontrolle von lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen auf bestimmte Stoffe und ihre Rückstände (ABl. L 65 vom 5.3.1998, S. 31) zu beachten.

11.2.2

Bezüglich der routinemäßig anwendbaren Verfahren zur Rückstandsanalytik sind die Anforderungen der Entscheidung 2002/657/EG, die vom Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz im Bundesanzeiger bekannt gemacht werden, zu beachten.

Folgende Analyseverfahren sind zugelassen:

-

Immuntest;

-

Dünnschichtchromatographie;

-

Flüssigchromatographie;

-

Gaschromatographie;

-

Massenspektrometrie;

-

Spektrometrie.

Außerdem können andere Analysemethoden oder Kombinationen von Methoden (zum Beispiel LC-MS, MS-MS, GC-IR), als Screening- und Bestätigungsmethoden eingesetzt werden, wenn sie vergleichbare Kriterien erfüllen, die gewährleisten, dass der Analyt in der für die Beurteilung maßgeblichen Konzentration eindeutig nachgewiesen werden kann.

11.2.3

Der Probe ist ein Antrag auf Rückstandsuntersuchung sowie Darstellung der Untersuchungsergebnisse beizufügen.

11.3

Untersuchung von Därmen auf fettlösliche Pestizidrückstände

Vor der Aufnahme der Untersuchung von Rinderdärmen ist sicherzustellen, dass diese aus einem Land stammen, aus dem auf Grund des Gemeinschaftsrechts das Verbringen oder die Einfuhr zulässig ist.

11.3.1

Methode zur einheitlichen Probenvorbereitung

11.3.1.1

Untersuchungsmaterial

Die aus einer Sendung gezogenen Einzelproben werden zu einer Sammelprobe zusammengefasst. Der Umfang dieser Sammelprobe beträgt mindestens 300 g.

11.3.1.2

Därme mit einem Fettgehalt unter 10 % (Dünndärme, Saitlinge, Blasen u. a.)

11.3.1.2.1

Probenaufbereitung

Die Darmabschnitte der Sammelprobe werden in ca. 5 cm lange Stücke geschnitten, auf einem halbrunden Haushaltssieb aus Nylongewebe (Durchmesser mindestens 20 cm) in einem Wasserbecken 20 Minuten in fließendem kaltem Leitungswasser entsalzt und anschließend kurz mit destilliertem Wasser abgespült. Die salzfreien Stücke werden entweder ungefroren zusammen mit Trockeneis oder nach vorherigem Einfrieren zerkleinert, durchmischt und homogenisiert. Der Zerkleinerungsprozess muss abgeschlossen sein, bevor das Untersuchungsmaterial wieder aufgetaut ist.

Ein aliquoter Teil der homogenisierten Probe wird für die Untersuchung auf Organochlorpestizide verwendet, ein weiterer Teil dient der Bestimmung der Trockenmasse (Seesandmethode, Trocknung bei +103 °C ±2 °C zum Erreichen der Massenkonstanz, etwa 5 Stunden). Das hierbei anfallende Seesand-Trockenmasse-Gemisch wird für eine eventuell notwendig werdende quantitative Fettbestimmung aufbewahrt. Zwei weitere Teile der Probe werden als Gegenprobe und eventuell erforderliche Schiedsprobe gefriergelagert.

11.3.1.2.2

Probenbeurteilung

Der ermittelte Rückstandsgehalt wird entsprechend der Fußnote 1 der Anlagen 1 und 2 der Rückstands-Höchstmengenverordnung auf das Gesamtgewicht, d. h. in diesem Fall das Frischgewicht der Darmproben, bezogen. Hierbei wird ein Wasseranteil von 80 % in frischen Därmen zugrunde gelegt.

Berechnung:	FG =	PE × TM
		20

wobei	„FG“	=	Frischgewicht der Darmprobe (g),
	„PE“	=	Probeneinwaage (g),
	„TM“	=	Trockenmasse (%) bedeuten.

11.3.1.3

Därme mit einem zu erwartenden Fettgehalt von über 10 % (Fettenden, ggf. Schweinekrause)

Bei Därmen mit einem Fettgehalt von über 10 % wird gemäß Fußnote 1 der Anlagen 1 und 2 der Rückstands-Höchstmengenverordnung der Pestizidrückstandsgehalt auf den Fettanteil bezogen. Die Proben werden wie in Nummer 11.3.1.2.1 beschrieben behandelt und nach Nummer 11.3.1.2.2 beurteilt. Hierbei sind die frischen Därme auf 20 % fettfreie Trockenmasse zu normieren.

11.3.1.4

Aus der für die Untersuchung auf Organochlorpestizide vorgesehenen Teilprobe wird mit Hilfe einer für die Rückstandsbestimmung geeigneten Methode das Rohfett extrahiert. Überschreitet der Rückstandsgehalt, bezogen auf Rohfett, den zulässigen Höchstwert, so ist mit der von der Trockenmassebestimmung verbliebenen Restprobe eine quantitative Fettbestimmung (Soxhlet-Methode) anzuschließen. Auf die Fettbestimmung kann verzichtet werden, wenn der festgestellte Pestizidgehalt, auch bei Bezug auf das Frischgewicht der Därme, die Höchstmenge überschritten hat. Wird bei der Fettbestimmung die 10 %-Grenze überschritten, ist der Pestizidgehalt auf das Fettgewicht, andernfalls auf das Frischgewicht der Därme zu beziehen.

11.3.2

Durchführung der Untersuchung

Die Untersuchung richtet sich nach den Vorschriften L 00.00-38 (Teile 1 - 4) „Fettreiche Lebensmittel - Bestimmung von Pestiziden und polychlorierten Biphenylen (PCB)“ der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG.